[发明专利]大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法

摘要

本发明公开了一种大熊猫白细胞介素7基因IL-7免疫佐剂的构建方法，包括以下步骤：从大熊猫外周血中分离出淋巴细胞，通过刀豆蛋白A(ConA)刺激培养后，首次PCR扩增得到大熊猫白细胞介素7基因，并克隆到真核表达载体pCI-neo，构建了真核表达质粒pCI-IL-7，其表达的IL-7作为疫苗佐剂能显著增强乙型脑炎病毒(JEV)核酸疫苗诱导的免疫应答，特别是体液免疫应答，能提高乙型脑炎病毒疫苗以及其他常规疫苗的免疫效果，控制疾病的发生与流行，保护大熊猫的健康。

主权项

一种大熊猫白细胞介素7基因IL‑7免疫佐剂的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：A1 IL‑7基因的PCR克隆A11 IL‑7基因的引物设计及合成根据NCBI上公布的预测的熊猫IL‑7基因序列，通过在线信号肽预测软件找出分析出其信号肽，设计一对引物，扩增成熟的IL‑7基因；I1：GAATTCACCATGGATTGTGATATTGAAGGTAAAGACG；I2：GTCGACTTAATGCTCTTTAGAGCCCCTC；A12 大熊猫外周血淋巴细胞RNA的提取；A121 外周血淋巴细胞的分离和培养；通过下列方法进行刺激培养，增加细胞因子的转录翻译：(1)采大熊猫静脉血2ml加入肝素抗凝管；(2)轻轻摇动抗凝管，使血液与抗凝剂混匀，5min后加入2m1Hank’s液，手动轻轻摇匀；(3)用毛细吸管吸取稀释后的抗凝血，全部沿管壁缓慢加至另一含4ml淋巴细胞分离液的试管液面上，注意保持两种液体界面清晰；(4)将试管平衡后置水平式离心机，4℃，2000rpm离心10min；(5)用毛细吸管仔细吸取血浆与分离液界面处淋巴细胞层至一刻度离心管内；(6)加入Hank’s液5ml，手动旋转试管使液体混匀，2000rpm离心10min，弃上清；(7)用5ml Hank’s重悬，2000rpm离心10min，弃上清；(8)用5ml含10％血清的1640营养液重悬淋巴细胞后转移至细胞瓶中，置37℃C02培养箱培养，半小时后加入刀豆蛋白conA，使其终浓度为7ug/ml；(9)置37℃CO2培养箱悬浮培养72小时；A122 RNA的提取；A13 IL‑7基因的扩增；A2 pMD‑IL‑7质粒的构建；A21 连接和转化；取pMD19‑T载体和回收的IL‑7的cDNA，于16℃连接过夜，然后将连接产物转化到DH5α；A22 pMD‑IL‑7重组质粒的鉴定；将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行测列，将测序正确的质粒命名为pMD‑IL‑7；A3 pCI‑IL‑7真核表达质粒的构建；A31 IL‑7基因的酶切回收；用EcoR I和Sal I对pMD‑IL‑7进行双酶切；酶切产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的基因；A32 pCI‑neo载体的酶切回收用EcoR I和Sal I对pCI‑neo进行双酶切；酶切产物通过1％琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收5400bp左右的载体基因；A33 连接与转化取酶切回收的pCI‑neo载体片段和酶切回收的IL‑7目的基因，于16℃连接过夜，然后通过热激法转化到DH5α；A34 重组质粒的鉴定将转化好的菌扩大培养后，小量提取质粒，用EcoR I和Sal I对重组质粒进行双酶切鉴定；用1％的琼脂糖凝胶电泳，并在紫外灯下观察电泳图；将酶切鉴定为阳性的重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司测序，将测序正确的质粒命名为pCI‑IL‑7。