[发明专利]漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法及其应用

摘要

本发明涉及生物技术领域，更为具体的说是涉及漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法及其应用。本发明的目的在于对治理富营养化水体过程中的漂浮植物根系表面附着的反硝化细菌的丰度的绝对定量方法进行研究，进而研究根系表面反硝化细菌nirK的变化规律，为后续漂浮植物在治理富营养化水体过程的应用及优化提供监测数据。本发明公开了一种漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，通过取样、PCR扩增、实时荧光定量PCR检测准确获得反硝化细菌数量。与传统技术相比，具有灵敏度高、特异性强、重复性好、成本低、操作方便和直观等优点。

主权项

1.漂浮植物根系表面附着反硝化细菌中nirK基因的丰度实时检测方法，其特征在于:所述的实时检测方法为荧光实时定量PCR检测方法，包括以下步骤：a）在待检测河流的漂浮植物种植区域建立对角线5点采集点并标记为采样点，在采样点采集植物根系样品，汇总后混合均匀；用无菌水清洗数次，吸干水分，随机选取2g新鲜根系，放入装有无菌去离子水的无菌三角瓶中，并加入灭菌的玻璃珠，超声5~15s，剧烈震荡15~30min，过滤，取滤液；滤渣再用无菌去离子水反复冲洗，冲洗液过滤，两次滤液合并，经0.22μm的微孔滤膜抽滤，滤膜放入Eppendorf管中，保存于-80℃；分别在每个采样点进行四次采样，并重复上述步骤，得到多个采样样本；b)将滤膜在无菌条件下剪成1-2mm的碎屑，通过E.Z.N.A.^®WaterDNAKit试剂盒分别提取样本的总DNA，并将样本的总DNA溶于ddH₂O中，以nirK基因的特异性通用引物对SEQIDNo.2和SEQIDNo.3对每个样本DNA进行PCR扩增，获得大小在500bp的特异性片段；PCR扩增产物经TA克隆构建质粒后进行测序，确定引物的特异性及PCR扩增产物为目标片段；提取经测序后的阳性克隆作为标准质粒测定DNA浓度并换算为拷贝数，按10倍梯度稀释后用以绘制标准曲线；由荧光定量PCR仪根据荧光信号的变化及标准曲线直接测出样本DNA中nirK基因的丰度。