[发明专利]二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法

摘要

本发明公开了一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，包括pMDl8-T-ipaH标准品的制备、荧光定量PCR快速检测志贺菌等步骤。本发明方法简便、易操作；具有灵敏度更高，成本更低的优点，为开发新型病原体检验试剂盒和科研应用奠定了基础。

主权项

1.一种二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌的方法，其特征是：包括下列步骤：（一）pMDl8-T-ipaH标准品的制备（1）引物的设计与合成：根据GenBank公布的福氏志贺菌M32063株ipaH基因序列，采用Primer5.0软件设计PCR引物，上游引物F1：5'-GCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'下游引物R1：5'-AGTACAGCATGCCATGGTCC-3'；（2）cDNA的提取接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上,连续画线，37℃培养12～16h；刮取1～2个接种环菌苔加入100μl三蒸水中,混匀,100℃煮沸10min；12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；（3）用普通PCR体系扩增；（4）PCR产物回收根据欲回收的PCR产物的量确定加样孔的大小，灌制1.5％琼脂糖凝胶；将待分离的PCR产物点样电泳；紫外灯照射下切取含有目的片段的琼脂糖凝胶块，转至1.5ml离心管中称重；按凝胶的质量加入1.5倍量体积的Binding Buffer，每2min颠倒混匀一次，在55℃～60℃下温育8min，且每隔2min弹试管底部，直至胶溶解完全，放置使其冷却至室温；将此液体转至柱子中，室温静置2min，室温下10000rpm，弃废液，将离心柱放回收集管中；加入300μl Binding Buffer，室温静置1min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；加入700μlSPW Buffer，静置2～3min，室温下10000rpm，弃液；13000rpm开盖离心2min以去除柱子中残余的乙醇；将柱子放入一个新的1.5ml离心管中，向柱中央加入在60℃下预热的30μl双蒸水，室温放置1min，13000rpm离心2min；回收得到的产物经电泳鉴定并定量，－20℃保存备用；（5）连接：pMD18-T载体1.0μl、DNA连接酶Ⅰ5.0μl、PCR回收产物4.0μl，16℃下连接过夜；（6）连接产物的转化：取100μl贮存于－70℃的大肠埃希菌DH5α，冰浴化开；加入连接产物5μl，混匀，冰浴20min；42℃热休克90s，转移至冰浴中，继续冰浴2-3min；加入LB液体培养基200μl，在37℃摇床中以200rpm的速度摇45min；加入20mg/ml X-Gal40μl、200mg/ml IPTG4μl，混匀；涂在氨苄青霉素的1.5%琼脂LB平板，待胶表面没有液体流动时，37℃恒温倒置培养12-16h；（7）重组子筛选：用消毒的小枪头挑取独立、分离的白斑4-6个，分别置于内含5ml液体LB培养基及相应抗生素的15ml离心管中，37℃，250rpm振荡培养过夜；（8）质粒抽提：取1.5ml培养物倒入离心管中，室温离心10000rpm，弃上清，倒扣，使液体尽可能流尽；加入250μl预冷的质粒抽提试剂盒的溶液Ⅰ，剧烈振荡；加入250μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀；加入350μl质粒抽提试剂盒的溶液Ⅲ，颠倒数次混匀，出现白色絮状沉淀；室温离心，12000rpm；取柱子至2ml收集管中，吸取上清于柱子中，室温离心，12000rpm,弃液；加入500μl大肠杆菌HB，离心，12000rpm，弃液；加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；加入750μl Wash Buffer，室温离心，12000rpm，弃液；空甩1次，室温离心，12000rpm；将柱子装入一干净1.5ml离心管中，加入50μl双蒸水于柱子膜中央，室温放置1-2min，离心，10000rpm，即获得质粒DNA；（9）标准品获取和定量：将步骤（8）得到的质粒DNA转种于LB液体培养基，250rpm震荡增菌培养过夜扩培，然后用质粒提取试剂盒提取质粒；根据260nm的吸光度值(A₂₆₀)计算出样品中DNA的含量，即1个OD值相当于50μg/ml双链DNA；取重组质粒样品1μl，用49μl双蒸水稀释，加入比色杯中，在紫外分光光度计上测定A260；重组质粒浓度计算：质粒的分子量=碱基总数×2×324.5(碱基的平均分子量)将提取的质粒稀释数倍后用紫外分光光度计测量仪器测量并计算得到提取的质粒浓度；DNA拷贝数的计算公式为：DNA相应拷贝数/μl=阿佛加得罗常数×DNA质量数/重组质粒DNA分子量阿佛加得罗常数:6.02×10²³；重组质粒DNA分子量=(2692+150)×2×324.5pMD18-T载体碱基数为2692bp，克隆片段为150bp，碱基平均分子量324.5；DNA质量数=重组质粒DNA浓度×稀释倍数带入上述公式后即计算出相应拷贝数，再将该质粒进行倍比稀释就得到一系列已知浓度的质粒，于－20℃保存备用；（二）二聚体蝎型探针荧光定量PCR快速检测志贺菌（1）荧光定量PCR引物、探针的设计：以构建重组质粒pMDl8-T-ipaH为模板，使用primer premier5.0设计检测用探针，二聚体蝎型探针的上游引物与标记荧光报告基团的核苷酸链由HEGF3连接如下：5'-FAM-CCGACACGCCATAGAAACGC-HEG-AGCTCTCCACTGCCGTGAAGG-3'淬灭链：5'-GCGTTTCTATGGCGTGTCGG-DABCYL-3'下游引物R2为：5'-ATAGCTTCGGCAGTGCGGAGG-3'；（2）DNA的提取接种福氏志贺菌单菌落于1.5%琼脂平板上，连续划线，37℃培养12～16h；刮取1～2个接种环菌落加入100μl三蒸水中，混匀，100℃煮沸10min；12000rpm离心10min，取上清，－20℃保存备用；（3）荧光反应：荧光反应体系如下：DNA模板1μl、0.2μlTaq酶、2μl Mg²⁺、2μl报告探针F3、2μl淬灭链、2μl R2引物、1.6μl dNTP、2μl10×Buffer、7.2μl ddH2O；循环参数：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号；（4）标准曲线制作将上述己定量的重组质粒DNA标准品进行10倍梯度稀释得十个浓度的系列标准品：10⁸～10¹拷贝/μl，分别以每个浓度标准品作模板，进行荧光定量反应，以浓度的对数为X轴和相应的阈值循环数为Y轴制作标准曲线，经软件处理得标准曲线；标准曲线Y=－3.4658X+38.696，相关系数为0.9972；反应体系：反应条件：93℃预变性3min；93℃变性20s，53℃退火延伸15s，共40个循环，53℃收集荧光信号，反应结束后利用荧光定量PCR软件分析；（5）将步骤（3）得到的荧光信号与标准曲线进行比对，即得到志贺菌的量。