[发明专利]一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法

摘要

本发明提供了一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法，对接毒的PK-15细胞用不同浓度梯度D-氨基葡萄糖处理，利用IFA筛选，不但能够使PK-15细胞正常生长，而且PCV2病毒滴度有显著提高，该方法获取的PCV2病毒的滴度不低于10⁵TCID₅₀,筛选的适宜D-氨基葡萄糖浓度对PCV2的增殖和操作方法，用于PCV2疫苗和相关诊断试剂的研究与产品制备。

主权项

一种猪圆环病毒Ⅱ型的制备新方法，其特征在于：分步实施；步骤1 PK‑15细胞的培养：  取复苏密度为1.0×10⁶的PK‑15冻存细胞1.8ml，置于37℃水浴中，晃动溶解1‑2min，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10‑15ml细胞培养液，再转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中，培养72h，用浓度0.25%的EDTA‑胰酶3‑5ml消化细胞，再用含10%胎牛血清的DMEM细胞培养液5ml，稀释成1.0×10⁶的PK‑15细胞悬液，在1000rmp下，离心10min，弃去上清，加入10‑15ml细胞培养液，转入75cm²培养瓶中，置于37℃、5% CO₂培养箱中，培养72h，得到PK‑15细胞；步骤2病毒培养液的配制在盛有950mL DMEM培养液的容器中，加入50 mL胎牛血清，混合均匀，加入终浓度为2mM的D‑氨基葡萄糖溶液20mL，得病毒培养液，其中培养液含5%胎牛血清；步骤3病毒的繁殖将1.0×10⁶的PK‑15细胞悬液1mL与1×10⁴TCID₅₀PCV2 1mL同步接种于细胞培养瓶中，加入13mL步骤2的病毒培养液，在37℃、 5% CO₂条件下，培养成致密单层，收集培养液。