[发明专利]一种高效筛选低温噬菌体的方法

摘要

本发明公开了一种用于从环境中高效筛选低温噬菌体的经济适用方法，可反复利用六孔细胞培养板，通过双层平板法筛选低温噬菌体，其采用的改良的PYGV底层培养基为组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基或者为缺少2×维生素和/或25%D-葡萄糖的1/10PYGV培养基，该方法所用培养基含量仅为普通方法的1/30，不但节约成本、经济，而且效率很高，在同样的培养时间和空间内，可提高效率近2.5倍，适用于实验室和现代生物工程中环境中低温噬菌体的分离等领域。

主权项

一种高效筛选低温噬菌体的方法，其特征在于具体操作步骤如下：（1）低温宿主菌的分离将采集的土样或水样，通过常规稀释平板法在改良的PYGV培养基上、15‑28℃条件下分离纯化得到不同种类的低温宿主菌，将分离得到的低温宿主菌分别接种到改良的液体PYGV培养基中，10‑28℃下150rpm培养10‑18h，直到宿主菌的浓度达到107‑109CFU/ml；（2）噬菌体富集液的制备将采集的土样或水样加入到改良的液体PYGV培养基中，置于4‑15℃静置培养1‑2周，吸取富集液，离心去除菌体，然后通过0.22μm的滤膜过滤，滤液即为噬菌体富集液，用于噬菌体的分离，其中样品和液体培养基混合的比例为5‑10g土样或5‑10ml水样加入到100ml培养基；（3）双层平板法分离低温噬菌体采用六孔细胞培养板作为培养皿，先在六孔细胞培养板中倒入改良的PYGV底层培养基，凝固后待用；上层半固体培养基采用3‑5 g/L的琼脂糖作为凝固剂，其余成分同改良的PYGV底层培养基；分离低温噬菌体：将100‑300μl噬菌体富集液分别与200‑400μl不同宿主菌菌液混合，10‑28℃静置10‑30 min，然后加入2‑3mL加热融化并冷却至20‑30℃上层半固体培养基，混匀，倒入改良的PYGV底层培养基上，形成双层平板，10‑28℃培养2‑3d，观察噬菌斑产生情况； （4）低温噬菌体纯化挑取单个噬菌斑，接种于改良的液体PYGV培养基中，经稀释后重复噬菌斑实验，直至噬菌斑的大小和形态特征保持均匀和一致，即得到纯化的低温噬菌体；其中所述改良的PYGV底层培养基为组分含量为常规PYGV培养基组分含量1/10的培养基或者为缺少2×维生素和/或25% D‑葡萄糖的1/10PYGV培养基。