[发明专利]一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法

摘要

本发明涉及一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，属淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以昆明裂腹鱼腹鳍组织为材料，采用组织块法，在含有胎牛血清和细胞生长因子，pH值为7.0-7.2的DMEM/F12培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、原代培养耗时短，细胞量大，能用于染色体分析；2、构建的昆明裂腹鱼鳍细胞系形态为成纤维样，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对昆明裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；3、该构建方法也适用于其他鱼类构建鳍细胞系。

主权项

一种昆明裂腹鱼鳍细胞系的构建和超低温冷冻保存方法，其特征在于该方法的具体步骤如下： （1）制备PBS消毒液和细胞培养液 PBS消毒液：向PBS中加入抗生素，使青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200μg/ml，庆大霉素浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml； 基础培养液：向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清，使胎牛血清体积占总体积的10%； 原代培养液：向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为10ng/ml，青霉素浓度为200IU/ml，链霉素浓度为200μg/ml，庆大霉素浓度为20μg/ml，两性霉素B浓度为20μg/ml； 传代培养液：向DMEM/F12培养液中加入胎牛血清、细胞生长因子bFGF和抗生素，使胎牛血清体积占总体积的15%，bFGF浓度为6ng/ml，青霉素浓度为100IU/ml，链霉素浓度为100μg/ml，两性霉素B浓度为10μg/ml； 调节上述培养液的pH值为7.0‑7.2，放置于4℃冰箱中保存备用； （2）原代培养 以75%的酒精消毒昆明裂腹鱼鱼体三次，置于超净工作台中，用无菌解剖器械取其腹鳍，置于无菌培养皿中，PBS消毒液清洗腹鳍组织5次后，用无菌器械剪成组织小块，并将其接种于25cm2细胞培养瓶中，加入原代培养液5ml于20℃培养箱中启动原代培养，每三天半量更换培养液，第2天细胞开始从组织块中迁移，20天长成细胞单层； （3）传代培养 原代腹鳍细胞铺满瓶底80%后开始传代，传代培养具体方法如下，先吸出培养瓶中的原代培养液，加入0.1%的胰蛋白酶‑EDTA溶液1ml，消化2min，细胞变圆后，加入传代培养液1ml以中和胰酶反应，吹打瓶底，使贴壁细胞脱落，首次传代按体积比1:1传，此后按体积比1:2或1:3进行传代，于20℃培养箱中继续培养；每5天传代一次，传至第10代时，细胞培养液换成基础培养液，此时，细胞系建立成功； （4）细胞冻存与复苏 （a）配制细胞冻存保护液:冻存液包括DMEM/F12培养液，胎牛血清和DMSO，按7:2:1的体积比混合，现用现配； （b）细胞冻存：取对数生长期的细胞，经上述胰酶消化后，细胞悬液1200rpm离心8min，弃掉上清液，向细胞沉淀中加入配制的细胞冻存液，重悬，使细胞的浓度为1×106个/ml，将1ml细胞悬液转移至1.8ml冻存管中，将冻存管置于程序降温盒中，‑80℃过夜，然后放入液氮中长期保存； （c）细胞复苏：将上述冻存管从液氮中取出，放入37℃水浴锅中快速摇晃至融化，然后在无菌操作台中，将解冻细胞转移至15ml离心管中，并加入等量基础培养液，1000rpm离心8min，除上清液，用基础培养液重悬细胞，并转移至细胞培养瓶中，20℃培养箱中培养，7天细胞即长成单层。 （5）各步骤中所用百分比均为体积百分比。