[发明专利]杆状病毒HearNPV LEF-9蛋白多克隆抗体的制备

摘要

本发明涉及杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白多克隆抗体的制备。通过设计引物克隆lef-9基因；原核表达构建重组质粒pET-28a-lef-9；将构建的重组质粒pET-28a-lef-9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF-9蛋白的重组菌株；对LEF-9蛋白进行诱导表达及纯化，以制备的杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白为抗原，采用常规多克隆抗体制备方法制备抗血清，纯化抗血清，得到多克隆抗体。通过本发明的方法，实现了原核表达杆状病毒HearNPVLEF-9蛋白，可以用于后期制备其多克隆抗体，为进一步研究LEF-9蛋白的功能特性奠定了基础。为人们对杆状病毒RNA聚合酶有一个更全面和深入的了解，为进一步利用其构建高效的体外转录系统奠定了基础。

主权项

杆状病毒HearNPV LEF‑9蛋白多克隆抗体的制备，其特征在于步骤如下：1) lef‑9 基因的克隆：设计引物28a55F：5’‑gcgggatccatgtcgaaaacacgtggctcg‑3’和28a55R：5’‑gcgaagctttcatattaaaaacatgtctagcaaatg‑3’，以HearNPV基因组DNA为模版扩增lef‑9完整阅读框，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，59℃ 30s，68℃ 30s为一个循环，进行30个循环；最后68℃延伸7min，得到lef‑9基因PCR产物；2）原核表达载体的构建：用凝胶回收试剂盒回收lef‑9基因PCR产物，用HindIII和BamHI双酶切，同时用相同两酶双酶切原核表达载体pET‑28a，将酶切片段和载体通过T4 DNA连接酶连接，构建重组质粒pET‑28a‑lef‑9；3）重组表达菌株的构建：将构建的重组质粒pET‑28a‑lef‑9转化大肠杆菌BL21，构建表达LEF‑9蛋白的重组菌株；4）LEF‑9蛋白的诱导表达：将pET‑28a‑lef‑9阳性单菌落接种于5mL Kana抗性LB培养基中，37℃振荡培养过夜，取过夜培养物按1%体积接种于2管250mL新鲜LB培养基中，37℃振荡培养3h至OD600nm为0.6后，加IPTG至终浓度为0.4mmol/L，培养5h，离心收集菌体；5）LEF‑9蛋白的纯化：将步骤4）中收集的菌体重悬于5ml裂解缓冲液中， ‑70℃反复冻融3次,超声波破碎，条件为功率200‑300 W，超声3s停5s，总计20min，至菌悬液变澄清后12000 r/min离心15 min，重复3次，去除不溶性细胞碎片，获得含有LEF‑9蛋白的上清液，将该上清液通过Ni2+亲和柱，再用5倍柱体积的250 mM咪唑浓度洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱下来的蛋白并测A280，当有蛋白峰时开始收集样品，直至A280又恢复至基准线，得到纯化的LEF‑9蛋白；6）多克隆抗体制备：以步骤5）得到的LEF‑9蛋白为免疫原，按质量比1:1与弗氏完全佐剂混合均匀，按照常规多克隆抗体的制备方法，共免疫4次家兔，收集血清，分离，纯化后，得到杆状病毒HearNPV LEF‑9蛋白多克隆抗体。