[发明专利]一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，属于基因工程技术领域。本发明将淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂基因进行大肠杆菌原核表达，通过蛋白酶抑制剂活性检测试验，SWD蛋白酶抑制剂可以抑制细菌生长繁殖过程产生的蛋白酶的活性，而且具有广谱蛋白酶活性抑制剂作用，其在食品行业的抗菌处理、医药行业的抗菌药物开发等方面具有较大的应用价值。

主权项

一种淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于：方法步骤如下：1）淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂的cDNA的克隆与表达片段扩增：取体重约为20g‑30g的淡水小龙虾，在无菌条件下，解剖摘取肝脏组织各30mg‑50mg，进行总RNA的提取，之后，进行cDNA的反转录合成，并以此cDNA样品作为模板，进行PCR扩增反应，获得PCR反应产物；2）原核表达载体的构建与转化克隆菌株DH5α：将步骤（1）的PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，目的条带所在的胶条切胶回收之后利用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒进行片段回收，利用EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ核酸内切酶进行双酶切处理，之后，将经过EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ核酸内切酶双酶切处理的pET‑28a载体在16℃条件下连接10h‑12h，将连接产物转化大肠杆菌DH5α克隆菌株感受态细胞，转化过程利用“热激法”进行，获得LB固体培养基平板；3）阳性重组子的筛选与质粒提取：挑去步骤（2）中的LB固体培养基平板表面的白色菌落作为模板，利用表达引物SWD‑F：5′‑tac tca gaa ttc cag cgc aca cac tat gct‑3′与SWD‑R：5′‑tac tca ctc gag cct gac ctt agt tca tgc ac‑3′作为菌落PCR筛选阳性重组子的PCR反应引物，进行菌落PCR反应，程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性克隆菌株利用LB液体培养基进行摇瓶震荡培养10h‑12h，取生长状况良好的大肠杆菌菌株3mL，利用DNA质粒小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒；4）转化表达菌株BL21（DE3）与阳性表达菌株的筛选：将步骤（3）中的阳性重组质粒利用“热激法”转化大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株感受态细胞，并且，利用表达引物SWD‑F：5′‑tac tca gaa ttc cag cgc aca cac tat gct‑3′与SWD‑R：5′‑tac tca ctc gag cct gac ctt agt tca tgc ac‑3′作为菌落PCR筛选阳性表达菌株的PCR反应引物，挑去固体LB培养基表面的白色菌落作为模板，进行菌落PCR反应，程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火45s，72℃延伸30s，循环35圈，后延伸5min，根据PCR结果，将筛选得到的阳性表达菌株利用液体LB培养基3mL‑5mL进行摇瓶震荡培养，得到表达菌株培养液；5）SWD蛋白酶抑制剂分子的诱导表达：将步骤（4）中摇瓶培养的表达菌株培养液在无菌条件下吸取1mL，转接在新鲜的100mL液体LB培养基中，添加卡那霉素最终的质量体积浓度为100μg/mL，培养温度为37℃，摇床转速为180rpm‑200rpm，培养时间为3h‑4h，之后加入IPTG进行诱导表达，IPTG的最终物质的量浓度为0.1mmol/L‑1.0mmol/L，其他条件不变的情况下诱导表达4h‑5h之后，5000rpm‑6000rpm条件下低速离心收集菌体，菌体沉淀利用10mL的1×PBS缓冲液重新悬起之后，冰浴上进行超声波破碎，破碎后的液体经过 10000rpm‑12000rpm条件下高速离心收集获得上清液；6）SWD蛋白酶抑制剂分子的亲和纯化：取步骤（5）中的上清液5mL利用His‑tag镍柱进行亲和纯化，纯化结果利用质量体积比为15%的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，最终根据电泳结果合并目的重组蛋白质所在位置对应的1×elute洗脱液，得到目的SWD重组蛋白质1×elute洗脱合并液；7）SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白酶抑制剂活性的检测：将步骤（6）的目的重组蛋白质1×elute洗脱合并液，利用截留孔径为3500Da的透析袋对1×PBS缓冲液透析24h，12h期间更换一次1×PBS缓冲液，之后将透析后的淡水小龙虾SWD蛋白酶抑制剂分子的蛋白透析液进行蛋白酶抑制剂活性的检测试验。