[发明专利]一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法

摘要

本发明公开了一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，还公开了该DWD抗菌肽在制备抗菌蛋白与蛋白酶抑制剂蛋白方面的应用。利用本发明制备的重组中国对虾具有双乳清酸性蛋白结构域（DWD）抗菌肽能够直接抑制常见细菌的生长，而且可以抑制细菌生长过程中分泌的蛋白酶的活性，可以在食品抗菌生物试剂、医用抗生素替代品方面具有较大的应用前景。

主权项

一种中国对虾DWD抗菌肽分子的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：1）中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段的克隆：取中国对虾3只‑5只，无菌条件下解剖收集肝脏组织供100mg‑150mg，利用动物基因组DNA小量提取试剂盒进行中国对虾肝脏基因组DNA的提取，之后，以1μL‑2μL中国对虾肝脏基因组DNA作为模板，进行PCR反应来扩增中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳处理，并且在凝胶成像仪紫外灯下将目的片段所在凝胶条带切下回收，利用DNA胶回收试剂盒进行目的片段的纯化与回收，获得中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液；2）中国对虾DWD抗菌肽基因原核表达载体的构建：取步骤（1）的中国对虾DWD抗菌肽基因表达片段溶解液16μL，进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ的双酶切处理，20μL的体系中基因表达片段为16μL，内切酶EcoRΙ和XhoΙ各1μL，10×H Buffer缓冲液为2μL，同时，取大肠杆菌pET‑28a质粒载体溶解液10μL进行内切酶EcoRΙ和XhoΙ双酶切处理，20μL的体系中质粒载体溶解液为10μL，内切酶EcoRΙ和XhoΙ各1μL，10×H Buffer缓冲液为2μL，无菌水6μL，之后，取双酶切处理的DWD抗菌肽基因表达片段6μL，双酶切处理后的大肠杆菌pET‑28a质粒载体溶解液2μL，再加T4DNA连接酶1μL和10×ligation buffer缓冲液1μL，在16℃金属浴中进行连接10h‑12h，获得连接产物；3）转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞与阳性克隆子的筛选：将步骤（2）中的连接产物转化大肠杆菌克隆菌株DH5α感受态细胞（TaKaRa公司产品），主要是利用“热激法”进行转化，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μg/μL，固体LB培养基平板在37℃条件下培养10h‑12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD‑F：5`‑tac tca gaattc acg aga ggc ccg cta aag c‑3`和后引物DWD‑R：5`‑tac tca ctc gag tct gcg ctt aga cgg act g‑3`作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸5min‑10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，进行LB液体培养基震荡培养10h‑12h，获得阳性克隆菌株菌液；4）质粒提取：取步骤（3）中的阳性菌株菌液1mL，利用质粒DNA小量提取试剂盒进行质粒提取，获得阳性重组质粒；5）转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞与阳性表达菌株的筛选：将步骤（4）的阳性重组质粒，利用“热激法”转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）感受态细胞，卡那霉素的最终质量体积浓度为25μg/μL，固体LB培养基要求在37℃条件下过夜培养10h‑12h，之后，挑去固体LB培养基平板表面的单个白色菌落，以前引物DWD‑F：5`‑tac tca gaa ttc acg aga ggc ccg cta aag c‑3`和后引物DWD‑R：5`‑tac tca ctc gag tct gcg ctt aga cgg act g‑3`作为菌落PCR反应的一对引物，进行阳性克隆子的筛选，PCR反应的程序为：94℃预变性5min，之后是35圈循环，每圈循环为94℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃后延伸5min‑10min，PCR反应产物进行质量体积比为1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，并且将能够扩增出目的条带的阳性菌落进行菌种保存的同时，利用3mL‑5mL液体LB培养基进行液体震荡培养，液体摇瓶培养的条件为：37℃，180rpm‑200rpm，培养12h‑14h，获得阳性表达菌株菌液；6）中国对虾DWD抗菌肽的诱导表达与亲和纯化：将步骤（5）的阳性表达菌株菌液作为诱导表达的母液，从其中取1mL菌液在无菌条件下转接到一瓶100mL新鲜的液体LB培养基中，要求卡那霉素的最终质量体积浓度为50μg/mL，在37℃、180rpm‑200rpm条件下转培养3h‑4h之后，在无菌条件下加入IPTG进行诱导表达，IPTG最终物质的量浓度为0.1mmol/L‑0.5mmol/L，诱导表达的条件为在37℃、180rpm‑200rpm条件下诱导3h‑4h，之后，6000rpm低速离心收集菌体，用20mL1×PBS缓冲液重新悬起菌体沉淀，在冰浴中进行菌体沉淀的超声波破碎40min‑60min，结束后10000rpm‑12000rpm高速离心收集上清液，取5mL上清液利用His‑tag凝胶亲和纯化柱进行重组蛋白质的亲和纯化，最后根据蛋白质电泳的结果合并洗脱液，得到目的重组蛋白质1×elute洗脱合并液；7）中国对虾DWD抗菌肽液体抑菌功能检测：将步骤（6）的目的重组蛋白质1×elute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对1×PBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次1×PBS缓冲液，透析液经过10000rpm‑12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行液体抑菌功能检测；8）中国对虾DWD抗菌肽蛋白酶抑制剂活性的检测：将步骤（6）的目的重组蛋白质1×elute洗脱合并液利用截留孔径为3500Da的透析袋对1×PBS缓冲液进行24h透析，12h期间更换一次1×PBS缓冲液，透析液经过10000rpm‑12000rpm高速离心之后的上清液作为被检测样品进行蛋白酶抑制剂活性的检测。