[发明专利]稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，包括人PKM2基因的shRNA慢病毒表达载体的构建，慢病毒的包装、收获，DLD1结肠癌细胞慢病毒感染，稳定细胞株嘌呤霉素筛选和Real-time PCR、Western blot鉴定。实验结果证明，shRNA寡核苷酸序列可成功插入pLKO.1-puro表达载体中，且对PKM2基因表达的抑制效果显著、持续且稳定。制得的细胞株为研究PKM2在大肠癌细胞能量代谢、增殖、迁移和炎症等恶性特征中的调控作用提供实验材料。

主权项

一种稳定沉默PKM2基因表达的结肠癌细胞株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）根据PKM2基因的mRNA全序列，经Blast同源性比对证实特异性后应用RNAStructure4.4软件对靶mRNA序列的二级结构进行评估得到靶核苷酸序列，设计并合成靶向PKM2基因的shRNA寡核苷酸序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2；（2）将合成的shRNA寡核苷酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2等量混合，退火形成双链的shRNA，同时双酶切pLKO.1‑puro载体，电泳，切胶回收载体，用T4DNA连接酶将双链shRNA连接到载体pLKO.1‑puro上，转化大肠杆菌感受态，克隆扩增获得pLKO.1‑puro‑shPKM2重组质粒，重组质粒经双酶切、DNA测序鉴定；（3）培养HEK‑293T细胞，并接种到培养皿中，待细胞长到70%时，pLKO.1‑puro‑shPKM2重组质粒与慢病毒包装质粒pMD2.G、psPAX2以质量比4：3：1共转染HEK‑293T细胞；培养48h、72h后分别收集含病毒的上清培养基，合并后用于感染生长状态良好的DLD1细胞，用浓度为6μg/mL的puromycin筛选出单细胞克隆，并扩大培养即可。