[发明专利]黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法

摘要

本发明公开了黄瓜单拷贝基因在染色体上物理定位的方法，它是通过PCR扩增获得黄瓜单拷贝基因，然后对产物进行凝胶电泳回收纯化，以纯化产物为模板进行第二次PCR扩增，然后将第二次PCR产物标备探针。分别取黄瓜根尖和盛花期植株上的花蕾进行酶解，涂片法制片，挑选分散度高的片子，并进一步进行胃蛋白酶处理后，备用。最后将标好的探针杂交到处理好的载玻片上，在荧光显微镜下观察信号。本发明采用PCR扩增后切胶回收，之后再进行二次PCR扩增的方法，不仅可以去除基因组DNA的干扰，而且解决了切胶回收率低的问题；另外涂片法结合胃蛋白酶处理制作背景清晰且分散度高的片子可以提高信号的分辨率；通过此方法，可在染色体上直接检测到的最短长度为2kb的单拷贝基因，为黄瓜的细胞遗传学研究提供了可靠的保证。

主权项

一种黄瓜单拷贝基因的染色体物理定位方法，其特征在于：通过荧光原位杂交，能在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到最短长度为2.0kb的单拷贝基因的荧光原位杂交信号；所述的在黄瓜中期和粗线期染色体上检测到最短长度为2kb的单拷贝基因的荧光原位杂交信号，是通过以下方法获得的：1)黄瓜染色体上的单拷贝基因利用基因组DNA作模板，进行PCR扩增之后，1％的琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收；2)以切胶回收的DNA为模板，再进行二次PCR扩增，利用扩增后的产物标探针；3)取酶解好的花药或根尖，加入适量固定液制成悬浊液涂片，再利用涂片法制片，镜检，挑选染色体分散度高的制片，进一步利用胃蛋白酶消化去除细胞质后，干燥备用；所述根尖放入体积比为3∶1的甲醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小时；所述花药放入体积比为3∶1的乙醇∶冰醋酸固定液中固定至少24小时；所述花药和根尖的固定时间超过一周后将根尖和花药换到70％的乙醇中；所述制片过程具体为：①取出酶解好的其中的一个花药，放入另一新的1.5ml离心管中，加入100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，将花药捣碎，吸出30ul的含粗线期染色体的液体，涂于载玻片上，再加上100ul的乙醇∶冰醋酸固定液，在酒精灯上烧片干燥制片；②取出酶解好的其中一个根尖，放在干净的载玻片上用镊子敲碎，再加上100ul的甲醇∶冰醋酸固定液，在酒精灯上烧片干燥制片；4)将标好的探针杂交到黄瓜染色体上，通过荧光原位杂交检测信号。