[发明专利]一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法

摘要

一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法。它涉及一种一种微生物基因文库的构建方法。它利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)B29提供了一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法。构建方法：一、提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA；二、提取pUC19质粒；三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收；四、载体去磷酸化；五、连接和转化；六、文库扩增和保存。本发明利用枯草芽孢杆菌B29和pUC19质粒构建了枯草芽孢杆菌基因文库，可用于生物领域。

主权项

一种枯草芽孢杆菌基因文库的构建方法，其特征在于枯草芽孢杆菌基因文库按以下步骤构建：一、将活化好的枯草芽孢杆菌B29接种至LB固体培养基，30℃过夜培养，然后挑取单菌落转接于LB液体培养基中，再30℃、150r/min条件下培养6～8小时，再提取枯草芽孢杆菌B29基因组DNA；二、培养含有pUC19质粒DNA的大肠杆菌，然后提取pUC19质粒；三、基因组不完全酶切及不完全酶切产物回收将Sau3A原酶液以100倍稀释后加入不完全酶切反应体系，然后37℃水浴10min、再65℃、20min灭活Sau3A活性，用1%琼脂糖凝胶电泳检测；并回收3～5kb的DNA片段，保存备用；四、载体去磷酸化用BamHI酶酶切pUC19质粒DNA，然后向回收的pUC19质粒DNA大片段中加入10倍体积的去磷酸化缓冲液，5’端突出的DNA，按每100pmol5’磷酸基团加入1个单位的牛小肠碱性磷酸酶，37℃反应30分钟；然后再加入十二烷基磺酸钠至终浓度0.5%、加入pH值为8.0的EDTA至终浓度5mmol/L、加入蛋白酶K至终浓度50μg/ml，混匀后56℃反应30分钟，再10分钟灭活牛小肠碱性磷酸酶，冷却至室温后加入等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次；加入冰乙醇沉淀，离心，抽干，溶于无菌去离子水，‑20℃保存备用；五、连接和转化将步骤四pUC19去磷酸化质粒大片段和步骤三回收的不完全酶切产物放入混合连接体系，然后16℃连接过夜，再放入50μl冰浴上融化的感受态细胞E.coli DH5α中，轻轻混匀后冰浴中放置30min；之后42℃水浴中热激45s，再立即转移到冰浴中2min，而后加入500μl不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37℃、200r/min条件下培养1h；然后将已转化的感受态细胞E.coli DH5α加到含氨苄抗性的LB琼脂培养基上，倒置平板、置于37℃环境中培养8～12h；六、文库扩增和保存将步骤五培养出的菌落用灭菌牙签接种于含20mg/mL氨苄的LB液体中，在37℃、200r/min条件下振荡培养过夜，然后加入等体积已灭菌、浓度为40%的甘油，混匀，置于‑80℃冰箱中保存，即完成枯草芽孢杆菌基因文库的构建；步骤三中不完全酶切反应体系为20μl，由3.3μl枯草芽孢杆菌B29基因组DNA、14μl H₂O、0.5μl稀释Sau3A酶液、0.2μl牛血清白蛋白和2μl缓冲液组成；步骤四中去磷酸化缓冲液pH值为8.0，去磷酸化缓冲液中ZnCl₂浓度为10mmol/L、MgCl₂浓度为10mmol/L、Tris·HCl浓度为100mmol/L；步骤五中混合连接体系总体积为10μl，由10×连接酶buffer1μl、不完全酶切产物1μl、pUC19去磷酸化质粒大片段2μl、T4DNA连接酶0.1μl和H₂O5.9μl组成。