[发明专利]一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法

摘要

本发明涉及组织与细胞工程领域，尤其提供了一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，该方法通过显微操作法进行单细胞克隆制备，省去了传统方法中繁琐的细胞计数和反复稀释，能在短时间内完成单细胞克隆操作，提高了单细胞克隆形成率。通过本发明方法获得的乳腺上皮细胞，可以应用于研究不同世系乳腺上皮细胞的功能以及它们在泌乳过程中的相互作用。

主权项

一种获得山羊乳腺上皮细胞单细胞克隆的方法，包括以下步骤：1）山羊乳腺上皮细胞的分离和纯化；2）单细胞克隆培养基的制备；3）单细胞克隆的制备；其特征在于：所述步骤2单细胞克隆培养基的制备，具体包括如下步骤：a.细胞培养基的配制：配制体积比FBS：DF12为1:9的溶液，其中还含有5mg/L牛胰岛素、5mg/L氢化可的松、10μg/L表皮生长因子和10万IU/L青链霉素双抗；b.细胞培养基处理：在进行第四代传代培养的时候，在细胞传代24小时后，将培养基更换成上述全新的培养基，继续培养6‑8小时后收获培养基，离心除去杂质、微孔滤膜过滤除菌，分装后置于‑20℃冰箱保存备用；c.单细胞克隆培养基的配制：将上述处理获得的培养基与步骤a配制的细胞培养基等体积混合，再加入0.05倍体积的FBS，分装后置于‑20℃冰箱保存备用；所述步骤3单细胞克隆的制备，具体步骤如下：a.消化细胞：消化第四代山羊乳腺上皮细胞并吹打成单细胞悬液；b.稀释细胞悬液：移取20μL细胞悬液稀释于含有5mL、37℃预热后的单细胞克隆培养基的60mm培养皿中，吹打均匀；c.单细胞显微操作：在40倍视野下用10μL微量移液器吸取单个细胞，接种于含有37℃预热后的单细胞克隆培养基的24孔板中；上述a步骤中，所采用的消化方式为胰蛋白酶常规消化方式，采用常用的实验用0.25%胰蛋白酶、37℃、2‑5分钟即可完成；d.传代培养：培养观察并选取合适的单细胞克隆群落：将培养板置于培养箱中静置培养，24小时后在倒置显微镜下观察，标记含有1‑3个细胞的培养孔并补加500μL单细胞克隆培养基；总共培养48‑72小时后，在显微镜下用无菌枪头剔除多余的细胞，使得选定的每孔含有一个细胞，更换单细胞克隆培养基后继续培养；以后每48小时更换一半培养基并观察，4‑5天后即可得到单细胞克隆群落。