[发明专利]一种重组人骨形态发生蛋白‑2的纯化生产方法

摘要

本发明公开了一种重组人骨形态发生蛋白‑2的纯化生产方法。该方法包括如下步骤1）裂解含有rhBMP‑2蛋白的包涵体，得到包涵体裂解液；2）对所述包涵体裂解液依次进行亲和层析和阳离子交换层析，分离纯化得到变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液；3）对所述变性rhBMP‑2蛋白进行复性，得到复性rhBMP‑2蛋白粗品；4）对所述复性rhBMP‑2蛋白粗品依次进行亲和层析和凝胶过滤层析分离纯化，得到复性rhBMP‑2蛋白纯品。利用本发明所提供的方法纯化rhBMP‑2蛋白，制备的产品纯度达95%以上，蛋白收率为9.4%，内毒素和DNA残留均符合生物药物质量要求，本发明方法适于工业规模化生产；同时也为同类重组蛋白药物的研发生产提供参考。

主权项

一种重组人骨形态发生蛋白‑2的纯化生产方法，包括如下步骤：1)裂解含有重组人骨形态发生蛋白‑2的包涵体，得到包涵体裂解液；2)按照如下a1)和a2)的步骤对所述包涵体裂解液进行分离纯化，得到变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液：a1)将所述包涵体裂解液进行亲和层析，收集洗脱峰；所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；a2)将从步骤a1)中收集的洗脱峰进行阳离子交换层析，收集洗脱峰，即为所述变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液；所述阳离子交换层析中所采用的阳离子交换基团是SP，所采用的洗脱程序为NaCl一步洗脱；所述收集洗脱峰为收集进行所述NaCl一步洗脱过程中所产生的洗脱峰；3)对步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液进行复性，得到复性重组人骨形态发生蛋白‑2粗品溶液；4)按照如下b1)和b2)的步骤，对步骤3)中得到的复性重组人骨形态发生蛋白‑2粗品溶液进行分离纯化，得到复性重组人骨形态发生蛋白‑2纯品溶液：b1)将步骤3)中得到的复性重组人骨形态发生蛋白‑2粗品进行亲和层析，收集洗脱峰；所述亲和层析中所采用的配基为肝素，所采用的洗脱程序为NaCl线性洗脱；所述洗脱峰为NaCl在洗脱液中的浓度线性增至0.45M时开始起峰的紫外吸收峰；b2)将从步骤b1)中收集的洗脱峰进行凝胶过滤层析，收集洗脱峰，即为所述复性重组人骨形态发生蛋白‑2纯品溶液；步骤a1)中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：NaCl 0.35mol/L，Tris‑HCl 50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为8.5；步骤a2)中，进行所述NaCl一步洗脱所用的洗脱液的溶剂为水，溶质及其浓度为NaCl 0.75mol/L，磷酸二氢钠50mmol/L，尿素8mol/L；pH值为5.5；步骤b1)中，进行所述NaCl线性洗脱所用的洗脱液的pH值为8.5，溶质为NaCl，溶剂由终浓度为50mmol/L的Tris‑HCl，以及终浓度为3mol/L的尿素和水组成；所述线性洗脱的体积为10个层析柱柱体积；在进行的所述10个层析柱柱体积洗脱过程中，NaCl在所述洗脱液中的浓度由0.4M线性升至0.7M；步骤b2)中，所述凝胶过滤层析中所采用的层析介质的分离范围包括所述重组人骨形态发生蛋白‑2的分子量大小；步骤3)中，所述对步骤2)中得到的变性重组人骨形态发生蛋白‑2溶液进行复性，采用的复性液的溶剂为水，溶质及其浓度如下：0.1mol/L Tris‑HCl，0.5mol/L尿素，0.1mol/L 2‑环己氨基乙磺酸，0.2mol/L精氨酸，0.5mmol/L氧化型谷胱甘肽，1.0mmol/L还原型谷胱甘肽，pH8.5‑9.0。