[发明专利]一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法

摘要

本发明提供一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，包括鸡胚成纤维细胞的制备、病毒的培养、病毒灭活、疫苗乳化等步骤。与现有技术相比本发明采用了本土分离的禽呼肠孤病毒，免疫原性好，具有更高的保护率；本发明采用鸡胚成纤维细胞取代利用鸡胚绒毛尿囊膜接种方式繁殖禽呼肠孤病毒，节省了疫苗制备成本，各批间质量差异降低，产量大，病毒毒价和疫苗质量提高；本发明利用均质机对疫苗进行乳化，制备的疫苗为水包油包水型，相对于传统的油包水剂型而言该疫苗粘度低，粒度小，易吸收；本发明选用的佐剂在疫苗制备过程中无需要额外添加任何表面活性剂成分，制备的疫苗安全性好，避免了传统油佐剂难以吸收造成的副作用。

主权项

一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：1）病毒的培养、收获：取9‑11日龄的SPF鸡胚，制备原代鸡胚成纤维细胞，以2.5×106‑3.5×106细胞量/mL的接种量将制备的细胞接种于含有8%(v/v)胎牛血清的M199培养基中，于37℃条件下摇瓶培养过夜；当细胞长满培养基单层时，按细胞悬液0.1‑0.3%(v/v)的接种量向细胞悬液中接种毒价≥106.5TCID50/0.1mL的禽呼肠孤病毒，控制温度在37℃继续摇瓶培养60‑84小时，收获细胞培养物，反复冻融3次，得到含上清液的细胞毒液；2）病毒的灭活：将步骤1）得到的含上清液的细胞毒液置于灭菌容器内，根据病毒液体积加入甲醛溶液并调整甲醛终浓度至0.5‑2‰(v/v)，充分摇匀毒液，在摇床上调整摇床转速为180r/min于37℃条件下灭活12‑48小时；3）疫苗的制备：将灭活的病毒液以3500r/min离心20min，再经8层纱布过滤，弃去沉淀，用磷酸盐缓冲液将灭活的病毒液做1.5‑2倍（v/v）稀释，并置于28‑32℃水浴锅中进行预热至水浴锅温度，即为水相；取疫苗佐剂，充分混匀后置于28‑32℃水浴锅中预热至水浴锅温度，即为油相；将上述预热后的水相和油相按1:0.8‑1:1.2（w/w）比例混合，利用磁力搅拌装置进行预混合1h，然后采用均质机调整二级阀压力为20‑30bar、一级阀压力为400‑500bar对该混合物乳化2‑3次，即得到一种禽呼肠孤病毒水包油包水型灭活疫苗。