[发明专利]金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法

摘要

本发明公开了一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学和毒理学试验方法，药效学实验方法包括制备免疫增强剂、养殖场常见致病菌种的制备、免疫增强剂抑菌试验、免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验、免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验等。病毒学实验方法包括小鼠急性毒性实验、大鼠长期毒性实验、实验结果分析。本发明提供的试验方法表明免疫增强剂制剂具有明显的抗菌、退热和止咳平喘作用，血液学检查也显示中中草药组的各项免疫指标高于空白对照组；毒性试验也证明用过此药的实验动物体重、重要器官脏器系数及肉眼观察均无明显的差异或异常，证明金银花萃菊免疫增强剂是一种高效、安全的中草药制剂。

主权项

一种金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法，其特征在于，所述的金银花萃菊免疫增强剂的药效学实验方法包括制备金银花萃菊免疫增强剂、养殖场常见致病菌种的制备、金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验、金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验、金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验、实验结果分析；具体步骤如下：第一步，制备金银花萃菊免疫增强剂；金银花萃菊的处方由金银花、萃菊、鱼腥草、筋骨草、连翘、黄芩、板蓝根、黄芪、柴胡、甘草组成，制备时精选上述各种地道优质的中草药，按比例称取后，粉碎成粗粉末，用水浸泡30分钟以后，置于锅内煎3次，合并三次滤液，浓缩成1：1煎剂，按每ml药液含1g原药，装瓶灭菌备用；第二步，养殖场常见致病菌种的制备；选用养殖场常见的致病菌，细菌的培养繁殖采用普通营养琼脂培养基，具体制备方法为将营养琼脂完全溶解后，经121℃、20min高压灭菌后，倒入培养皿，平铺成3～5mm的培养基，冷却凝固后备用；菌株接种采用接种环和划线法；接种后置于37℃恒温培养箱培养24h，置于4℃冰箱中保存备用，第三步，金银花萃菊免疫增强剂抑菌试验；将直径为6mm的圆形滤纸片高压灭菌、干燥后置于1：1浓度的中草药煎剂浓缩液中浸润备用，然后在无菌操作柜内采用无菌操作法分别用不同涂布棒将上述菌株的新鲜培养物均匀地涂抹在琼脂培养基上，再将浸润过中草药的纸片均匀间隔紧贴于培养基表面，调整按压纸片使其接触良好后置于37℃恒温培养箱培养24h，然后取出观察其抑菌圈，测量抑菌圈直径D(mm)并记录其结果；判定标准按照《中药药理学》及《抗菌药物药敏试验判定标准》规定，抑菌圈直径≤10mm为低敏，抑菌圈直径≥10～18mm为中度敏感，抑菌圈直径≥18mm为高度敏感；第四步，金银花萃菊免疫增强剂对致热家兔模型的退热作用的实验；供试大耳白兔若干，，选择健康无病、体温合格大耳白兔18只，体温合格的标准范围为38.6‑39.5℃，每天测肛温3次，预试3d后，然后随机分为3组，试验前禁食12h但不禁水，试验开始前30min，再测肛温3次，每次5min，取其平均值作为该试验兔的基础体温；按照中草药药理试验方法学所嘱进行家兔模型造病，给每只实验兔耳缘静脉注射2，4‑二硝基苯酚1ml/100g (15mg/kg)待试验兔致热后30mi n，按照3组不同分组给药治疗，其中A组用人导尿管经口给兔胃内灌入金银花萃菊浓缩液10ml/kg/只；B组给予复方阿司匹林100mg/kg‑1；C组对照组给予生理盐水10ml/kg/只；实验动物均采用灌胃法给药；给药后30，60，90，120，180，240，300，360min分别测定试验兔肛温3次，取其平均值，并以该试验兔体温与基础体温的差值作为观察指标进行t检验，比较中西药对各组试验兔的退热作用；第五步，金银花萃菊免疫增强剂对咳喘小白鼠模型的作用的实验；供试小白鼠30只，随机分成3组，每只重25±5g，雌雄各半兼用；其中A组金银花萃菊口服液组0.5ml (20g/kg)/只；B组复方磷酸可待因口服液30mg/kg；c组生理盐水对照组0.5ml(20g/kg)/只；实验动物均采用灌胃法给药，试验第一天上、下午各给药1次，试验第2天上午给药1h后，将实验动物放入装有恒压喷雾装置的箱笼中，在恒压下将浓氨水以喷雾状态均匀进入箱笼中，气压表上的压力以0.2个大气压或18.7kPa(140mmHg)为宜，喷雾时间约为30min，观察各组实验动物的咳嗽症状出现时间，典型咳嗽为小白鼠腹肌收缩，同时张大口，并有咳嗽声；计算各组动物的咳嗽症状的潜伏期和镇咳率；第六步，金银花萃菊免疫增强剂对小白鼠IgM、c3和c4的影响的试验；供试小白鼠60只，每只重25±5g，雌雄各半兼用，随机分成3大组，每大组20只，每大组分成两个小组，每小组10只，分为对照组和实验组；每小组 实验小白鼠饲喂相应的金银花萃菊口服液0.3ml/只/d；对照组灌喂生理盐水，0.3ml/只/d；连续饲养两周，进行采血检验；将小白鼠从笼中取出，右手提起住尾巴迅速旋转，使其眩晕，然后，放在地上，右手后拽尾巴，待小鼠前蹿时，左手食指和拇指迅速夹住其耳朵后的皮肤，再将尾巴握在掌中，使其眼珠突出，用镊子将眼珠拔出，滴出的血用小清瓶接住，标上记号；将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpm×3min，取上清液，于‑20℃保存；将采到的血相应的加入到做好标记的离心管中，低温离心8000rpm×3min，取上清液，于‑20℃保存；不加抗凝剂的立即离心，取血清；第七步，实验结果分析。