[发明专利]一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法

摘要

本发明涉及一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法。剪取成年猪皮肤，去除毛发、脂肪和污垢后于75%酒精浸泡，用PBS清洗后剪成小块，0.25%Trypsin中4℃消化过夜；皮肤块经DMEM高糖培养液清洗，0.25%Trypsin-0.04%EDTA消化、吹打后过400目细胞筛得到细胞悬液，转入猪皮肤干细胞培养液培养；原代培养3-4天的成年猪皮肤经PBS清洗，加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA润洗、消化，轻敲平皿侧壁使细胞脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，离心后弃上清将细胞重悬后传代。本发明方法操作简便，可重复性好，培养的成年猪干细胞表达β1-integrin和Nestin等皮肤干细胞特异蛋白，并且是碱性磷酸酶阳性。

主权项

一种成年猪皮肤干细胞体外高效分离培养的技术方法，其特征在于按照如下步骤操作：第一步，成年猪皮肤组织分离与清洗：剪取成年猪皮肤，剪掉皮肤外侧毛发，并刮掉毛孔中污垢，将皮下脂肪及结缔组织剪干净，于75%酒精浸泡进行灭菌处理，pH7.0磷酸盐缓冲液清洗除去残留酒精，将皮肤剪成2‑3mm2小块，置于0.25%Trypsin中4℃消化过夜以使皮肤变得松散；第二步，原代培养成年猪皮肤干细胞：皮肤块经DMEM/F12清洗，置于0.25%Trypsin‑0.04%EDTA，37℃消化30分钟，移液器吹打皮肤块，轻轻吹打混匀后加入10%胎牛血清终止消化，于DMEM/F12中清洗，并将细胞悬液过400目细胞筛，细胞悬液转入皮肤干细胞培养液培养，以培养当天为原代，每3‑4天传代一次；第三步，传代培养：原代培养3‑4天的成年猪皮肤干细胞经pH7.0磷酸盐缓冲液洗两遍，加入0.25%Trypsin‑0.04%EDTA润洗，之后加入0.25%Trypsin‑0.04%EDTA置于37℃消化10分钟，轻敲平皿侧壁使细胞从皿底脱落，将消化后的细胞悬液转移至离心管，1000转/秒离心后弃掉上清液，加入新鲜皮肤干细胞培养液将细胞重悬按照1板细胞传代为2板或者3板细胞的比例进行传代；其中，所述皮肤干细胞培养液为DMEM/F12；10%胎牛血清；2%B27；20ng/ml表皮生长因子；40ng/ml碱性成纤维细胞生长因子；1%青链霉素。