[发明专利]一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法

摘要

本发明公开了一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，通过包被不表达跨膜受体的细胞膜以及表达或高表达跨膜受体的细胞膜，成对、平行地进行差异化ELISA检测，可以大规模筛选针对跨膜受体的单克隆抗体。本发明类似于常规的ELISA，可以高通量、快速、便捷地筛选针对完整跨膜受体的单克隆抗体，具有非常高的检测灵敏度；筛选出来的候选抗体经过FACS验证确认。

主权项

1.一种跨膜受体的单克隆抗体的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：(1)免疫用抗原细胞稳定株的构建接种CHO‑DHFR‑至6孔板中，24h后用带有hETaR基因的载体转染，转染前更换培养液；48小时后，再换为含有浓度为150nM的甲氨蝶呤的完全培养基，每隔3天换液，待两周，出现稳定生长的克隆，逐渐提高甲氨蝶呤的浓度进行加压筛选，其中甲氨蝶呤使用浓度范围为150nM‑10μM；对构建的稳定细胞株分别进行FACS检测，10μM甲氨蝶呤筛选后的CHO‑DHFR‑hETaR细胞膜上hETaR有大量表达，经过克隆筛选获得高表达hETaR的稳定细胞株；(2)抗体的制备将在弗氏佐剂中乳化的高表达hETaR的稳定细胞株以10‑100μg的剂量皮下注射BALB/c小鼠；2周后，使用不完全弗氏佐剂乳化的高表达hETaR的稳定细胞株，加强免疫小鼠，此后每周加强一次；通过眼球放血或剪尾的方式采血，进行FACS检测血清效价；直至适合抗体滴度时，杀死小鼠，获取脾脏细胞，和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合；将所得的杂交瘤细胞在96孔板中进行培养，并进行次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷筛选，以除去非融合的细胞；7‑10天后收取培养板中的杂交瘤细胞的上清液进行ELISA检测；(3)细胞膜的制备用1mM的EDTA消化贴壁细胞，离心收集细胞后计数，‑80℃冷冻保存，或者直接用于细胞膜抗原的制备；用4℃预冷PBS 1x洗涤高表达hETaR的稳定细胞株，2000rpm离心5分钟后，完全移去上清；先用10ml缓冲液A重悬，用4#针头反复吹吸细胞液50‑100次后，补加20ml缓冲液A；10000rpm，4℃离心60分钟；沉淀用缓冲液A洗涤一次，离心后去除上清，沉淀用5‑10ml缓冲液B重悬；最后用蛋白浓度测定试剂盒进行膜总蛋白定量，分装，得CHO‑DHFR‑hETaR细胞膜，‑20℃保存；其中，所述缓冲液A的组成为10mM HEPES，1mM MgCl2，pH 7.4，0.1mM苯甲基磺酰氟，2x罗氏蛋白酶抑制剂；所述缓冲液B的组成为10mM HEPES,1mM MgCl2，pH 7.4，1x罗氏蛋白酶抑制剂；不表达hETaR的细胞膜来源为CHO‑DHFR‑，制备方法同上；(4)基于细胞膜的ELISA筛选用PBS将CHO‑DHFR‑hETaR或CHO‑DHFR‑细胞膜稀释成10μg/ml，以100μl/孔包被于高亲和力的96孔板中，4℃过夜；第二天吸去孔中液体，用0.05％PBST洗涤3次；200μl/孔加入1％酪蛋白的PBST溶液作为封闭液，置于37℃封闭2小时；经过酪蛋白封闭后，加入步骤(2)杂交瘤细胞的上清液4℃孵育90min；多次洗涤后，每孔加入100μl稀释的GxM‑HRP‑Fc二抗，37℃孵育0.5h；洗涤5次后，每孔加入100μl的3,3',5,5'‑四甲基联苯胺，显色底物，37℃反应15min，等体积的2M H2SO4终止，用酶标仪检测对比后，从而大规模筛选出单克隆抗体。