[发明专利]毛乳头细胞的培养方法

摘要

本发明公开了一种毛乳头(DP)细胞的培养方法，该培养方法能够长期培养DP细胞，并成功应用于DP细胞建系。

主权项

一种毛乳头细胞的培养方法，其特征在于包括如下步骤：配制溶液：0.25％Dispase(中性蛋白酶，也称为分散酶)溶液的配制：准确称取0.25g Dispase酶粉末，加入100ml0.01M PBS溶液，完全溶解后抽滤分装，4℃或‑20℃保存；2mg／ml胶原酶的配制：用TESCA缓冲液(50mM TES，0.36mM CaCl2，pH7.4)在37℃配制，配好后‑20℃分装保存；DP培养基的配制：α‑MEM基础培养基，加入10％胎牛血清，100×丙酮酸钠，100×非必需氨基酸，1000×青链霉素，10ng／ml bFGF；培养过程：1)取新生8～9d健康C57小鼠1只，颈椎脱臼处死，酒精棉球消毒触须部位；眼科剪垂直皮肤剪下大鼠两边触须皮肤，放入装有D‑Hank's液的培养皿中；用镊子夹着皮肤清洗，吸去多余D‑Hank's液；2)解剖显微镜下(×3.2)用27号针头将毛囊连同结缔组织鞘一起分出来，并转移到另一个装有D‑Hank's培养基的培养皿中；3)分离完毕后，在超净台中用吸管将D‑Hank's液吸干，加入质量分数为0.25％的Dispase，室温消化10‑30min，优选20min；4)消化完成后，将毛囊转移到大的培养皿中，加入D‑Hank's液将Dispase稀释，手术显微镜下将毛囊从真皮鞘中分离出来；5)在手术显微镜下分离毛乳头，收集移入离心管；6)向离心管中加入0.2％胶原酶，37℃消化5‑6小时；7)消化5‑6小时后，离心管中加入DMEM培养基终止消化，吹打，离心1000rpm，3min；8)弃上清，细胞用DP培养基重悬，于6孔板中培养，培养4d后观察， 常规方法传代；9)细胞传至第15代及以上时，收集细胞。