[发明专利]利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法

摘要

本发明公开了一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法。步骤包括：将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；将重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，并通过Ni-NTA亲和层析纯化，获得具有一定酶活性的脱氧胞苷激酶。本发明的有益效果在于经口添食家蚕，使脱氧胞苷激酶dck基因在家蚕体中表达纯化，与人工注射家蚕相比，省时省力提高了生产效率，为家蚕生物反应器产业化提供了技术支撑，并为抗肿瘤药物DCK的研究提供了物质基础，拓宽了杆状病毒表达系统生产人类急需的蛋白药物、基因工程疫苗等领域的应用前景。

主权项

一种利用双启动子表达载体在家蚕幼虫中表达纯化抗肿瘤药物脱氧胞苷激酶DCK的方法，其特征在于，步骤包括：(1)将通过修饰加有His标签的dck基因及polh基因分别克隆到双启动子表达载体以构建重组双启动子表达载体；(2)将所述重组双启动子表达载体转化到DH10Bac感受态细胞中，提取质粒，获得重组穿梭载体Bacmid；（3）所述Bacmid在转染试剂脂质体介导下转染家蚕培养细胞，获得重组病毒多角体；(4)所述重组病毒多角体定量后以经口接种五龄家蚕幼虫的方式，在家蚕幼虫中表达，表达产物通过Ni‑NTA亲和层析的方法纯化，获得具有酶活性的脱氧胞苷激酶DCK。