[发明专利]一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法

摘要

本发明公开了一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法。该方法包括如下步骤1）根据基因组DNA上的已知序列设计三条方向一致用于扩增侧翼序列的特异性引物，按距离侧翼序列由远及近的顺序将其依次记为GSP1、GSP2和GSP3；2）以基因组DNA为模板，以引物SAP（序列1‑15中任一）和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；3）以所述PCR产物1为模板，以引物SEP（序列16和17）和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP（序列18）和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3，从而获得所述侧翼序列。本发明所提供方法具有如下优点操作简易、高特异性扩增、高成功率、容易得到大的片段、耗时短等。

主权项

一种从基因组DNA中获得侧翼序列的方法，包括如下步骤：（1）选择基因组DNA上位于待扩增的侧翼序列旁侧的一个已知序列区，根据所述已知序列区的核苷酸序列设计三条方向一致用于扩增所述侧翼序列的特异性引物，将三条所述特异性引物按照距离所述侧翼序列由远及近的顺序，依次记为GSP1、GSP2和GSP3；（2）以所述基因组DNA为模板，以随机兼并引物SAP和所述GSP1进行第一轮PCR扩增，得到PCR产物1；所述随机兼并引物SAP为如下15种引物中的任一种：核苷酸序列如序列表中序列1所示的引物SAP1、核苷酸序列如序列表中序列2所示的引物SAP2、核苷酸序列如序列表中序列3所示的引物SAP3、核苷酸序列如序列表中序列4所示的引物SAP4、核苷酸序列如序列表中序列5所示的引物SAP5、核苷酸序列如序列表中序列6所示的引物SAP6、核苷酸序列如序列表中序列7所示的引物SAP7、核苷酸序列如序列表中序列8所示的引物SAP8、核苷酸序列如序列表中序列9所示的引物SAP9、核苷酸序列如序列表中序列10所示的引物SAP10、核苷酸序列如序列表中序列11所示的引物SAP11、核苷酸序列如序列表中序列12所示的引物SAP12、核苷酸序列如序列表中序列13所示的引物SAP13、核苷酸序列如序列表中序列14所示的引物SAP14、核苷酸序列如序列表中序列15所示的引物SAP15；（3）以所述PCR产物1为模板，以叠套引物SEP和所述GSP2进行第二轮PCR扩增，得到PCR产物2；所述叠套引物SEP由引物A和引物B组成，所述引物A的核苷酸序列为序列表中序列16，所述引物B的核苷酸序列为序列表中序列17；（4）以所述PCR产物2为模板，以引物SNP和所述GSP3进行第三轮PCR扩增，得到PCR产物3；从所述PCR产物3中获得所述侧翼序列；所述引物SNP的核苷酸序列为序列表中序列18；进行所述第一轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 120 s，1个循环；98℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃2 min，2个循环；98℃ 10 s，25℃ 2 min，0.2℃/s，68℃ 2 min，1个循环；98℃10 s，60℃30 s，68℃2 min，98℃ 10 s，60℃ 30s，68℃ 2 min，98℃ 10 s，44℃ 30 s，68℃ 2 min， 3‑5个循环；68℃ 5 min，1个循环；进行所述第二轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 120s；98℃ 10s，60℃ 30s，68℃ 2min，30个循环；68℃ 5min；进行所述第三轮PCR扩增的反应条件为：94℃ 120 s；94℃ 10 s，60℃ 30 s，68℃ 2 min，30个循环；68℃ 5min；进行三轮PCR扩增时的反应体系如下：（a）进行所述第一轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 10.0μL；2mM dNTPs4.0μL；浓度为10μmol的所述GSP1 0.6μL；浓度为10μmol的所述随机兼并引物SAP 3.0μL；基因组DNA 200‑500ng；1.0U/μL KOD FX 0.4μL；ddH2O补足至20μL；（b）进行所述第二轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs 10.0μL；浓度为10μmol的所述GSP2 1.5μL；混合浓度为2.2‑2.5μmol的所述叠套引物SEP 7.5μL，其中，引物A的浓度为0.2‑0.5μmol，引物B的浓度为2μmol；所述PCR产物1 1.0μL；1.0U/μL KOD FX 1.0μL；ddH2O补足至50μL；（c）进行所述第三轮PCR扩增的反应体系为：2×PCR Buffer for KOD FX 25.0μL；2mM dNTPs 10.0μL；浓度为10μmol的所述GSP3 1.5μL；浓度为10μmol的所述引物SNP 1.5μL；所述PCR产物2，1.0μL；1.0U/μL KOD FX 1.0μL；ddH2O补足至50μL。