[发明专利]一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法

摘要

本发明提供的一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法，提取绵羊颗粒细胞的总RNA，反转录成cDNA；依据绵羊FSHR基因cDNA序列的起始密码子上游和终止密码子下游，设计两对引物：上游引物F1：CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG;F2：CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA；下游引物R1：CTTATGGATGTGCCAGGGAG;R2：AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC；用获得的cDNA为模板，进行PCR扩增FSHR基因,采用天根胶回收试剂盒回收PCR产物；PCR产物加A尾及T载体克隆测序验证；获得的FSHR多种剪接形式完整编码区的序列特征为oFSHR₆₉₅,oFSHR₆₉₄,oFSHR₆₄₈,oFSHR₆₃₃,oFSHR₅₉₅。

主权项

一种获得FSHR多种剪接形式全长编码区序列的方法，其特征在于：步骤1提取绵羊颗粒细胞的总RNA，反转录成cDNA；即用10 mL注射器针头抽取绵羊卵泡液，转入1.5mL的离心管中，在12000rpm条件下，离心收集颗粒细胞，弃上清，沉淀加入1 mL的Trizol液，然后用1 mL注射器反复吹打8‑10次，至细胞充分裂解透明，室温放置5‑10 min,然后加入0.2 mL的氯仿，盖紧离心管，涡旋20 sec，在4℃、12000 rpm条件下、离心15 min,取上清置于另一1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀8‑10次，室温静置10 min,在4℃、12000rpm、离心10 min，弃上清液，加入1 mL 的75％乙醇混匀,继续在4℃、7500 rpm、离心5 min，弃上清，然后用移液枪吸干管壁上多余的乙醇，室温晾置3‑5min至乙醇挥发,沉淀加入50 μL 的无RNase水溶解，溶解后取2 μL RNA琼脂糖凝胶电泳，将质量好的RNA立即反转录成cDNA；步骤2引物的设计及PCR反应; 依据绵羊FSHR基因cDNA序列的起始密码子上游和终止密码子下游，设计两对引物：上游引物F1：CAAAAGGGCTCAGTGTGGAG;F2：CGTCTGCAGAAGCAGAAGCA；下游引物R1：CTTATGGATGTGCCAGGGAG;R2：AGTGCTCTGTCAGCTCTTGC；用步骤1获得的cDNA 为模板，以引物对F1/R1进行PCR 扩增FSHR基因，PCR扩增体系为50μL：5×Prime STAR Buffer 10μL, 2.5mM dNTP Mix2.5mM ture4μL, 10μM F1 1μL, 10μM R1 1μL，cDNA 模板1μL，2.5U/μL PrimeSTAR HS DNA Polymerase  0.5μL, 灭菌蒸馏水32.5μL；反应条件：98℃ 5min、 98℃ 10s、58℃ 15s、 68℃ 90s， 30个循环，68℃延伸10min，4℃终止反应；步骤3 PCR产物的纯化回收;   PCR 产物经1.0％琼脂糖100V电泳分离后，在紫外光下用消毒刀片切下与预期片段大小一致的DNA条带，用天根胶回收试剂盒回收PCR产物，取2μL 回收产物于1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，检测回收效率和纯度；步骤4 PCR产物加A尾及T载体克隆测序验证；PCR产物加A尾：2.5U/μL TaqE 1μL、胶回收产物 5μL、ddH₂O 2μL、             10×TaqE Buffer 1μL、 dNTP Mixture或dATP 1μL，72℃ 30min水浴，目的片段与载体连接，产物转化，蓝白斑筛选，F2/R2菌液验证，送阳性克隆测序，测序结果在NCBI上用blast在线比对分析。