[发明专利]一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法

摘要

本发明公开了一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上，对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料，采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10，对水稻组织进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体，可获得高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方法、反应时间及质粒浓度进行探索，在缩短原生质体分离时间的同时，大大提高了转化效率。用较微量的质粒DNA即可获得外源基因在原生质体内高效的表达，且转化效率可达70%以上。本发明有益的效果：它能够克服采用离心法分离原生质体造成细胞碎片等杂质含量高的缺陷；明确茎、叶原生质体的形态差异；得到高纯度的原生质体；增进转化效率。

主权项

一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：（1）水稻种子去颖壳，消毒；（2）消毒种子在1/2MS培养基上培养10‑15天，待其长成15‑20cm高的幼苗；培养条件：25℃，光照12h，黑暗12h，光照强度：8000Lux；（3）取水稻幼茎，剥去叶鞘，切成0.5mm大小片段，然后加入渗透剂，暗条件放置20‑30分钟；所述渗透剂为0.3mol/L山梨醇和50mM氯化钙的混合液TVL；（4）加入酶解液酶解细胞壁以获得原生质体；具体方法如下：在室温22‑25℃条件下，将酶解液加入的水稻幼茎和渗透剂的混合液中，真空抽滤1h；然后置于水平摇床上60r/min摇4h；（5）用25um的尼龙网膜过滤酶解后的混合物，弃滤渣；滤液上层缓慢滴加等渗的W5溶液，4℃滤液静置30min以上，待溶液分层；（6）吸取中层10ml的原生质体，用10mlW5溶液洗涤，100g离心5‑10min，弃上清，2‑3次，即获得较为纯净的原生质体；（7）原生质体转化：以终浓度为20%的PEG为媒介，将带有35S驱动的增强型绿色荧光蛋白EGFP的质粒pSTAN1转化进入原生质体：转化体系如下：10ul质粒，100ul原生质体用MMG溶解，110ul40%的PEG‑Cacl2；室温放置5‑15min，然后加入W5溶液至反应体系的总体积为1ml以终止反应；100g离心5min，去上清；再加入1ml W5悬浮原生质体，于25℃黑暗条件下培养2‑24小时。