[发明专利]高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法

摘要

本发明公开了一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，本发明由克隆ku70基因3’端和5’端DNA片段，构建ku70基因敲除载体，根癌农杆菌介导的转化，ku70基因敲除突变菌株的鉴定，本发明获得的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株与亲本谢瓦氏曲霉间型变种相比，生长速率略慢，其他表型未见明显变化，并且遗传稳定，可以作为受体菌株进行基因功能的敲除验证。本发明的谢瓦氏曲霉间型变种的工程菌株作为受体菌株，基因敲除效率较高，易于获得基因敲除突变菌株，减少了繁重的筛选工作。

主权项

一种高基因敲除效率的谢瓦氏曲霉间型变种工程菌株的构建方法，其特征在于：具体包括以下步骤：步骤（1）：以谢瓦氏曲霉间型变种基因组DNA为模板，采用引物P12和P13扩增Ku70基因3’端DNA片段D，用引物P10和P11扩增Ku70基因5’端DNA片段U；引物对P12的序列为5’‑CTAGTCTAGACCCGACAAGCCTGAGGACAA‑3’；引物对P13的序列为5’‑TCCTGAGCTCACGCTCTCTTCTATCAGACCCT‑3’；引物P10的序列为5’‑CCCAAGCTTTCAACCACCACCATCCGTCTC‑3’；引物P11的序列为5’‑CGGAATTCAATGTGACCTGCTCGCCTCC‑3’；步骤（2）：XbaⅠ和SacⅠ双酶切DNA片段D和质粒pDHt/sknt，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt‑D；HindⅢ和EcoRⅠ双酶切DNA片段U和质粒pDHt/sknt‑D，纯化后连接得到重组质粒pDHt/sknt‑D‑U，即为ku70基因敲除载体；步骤（3）：将Ku70基因敲除载体通过冻融法转入根癌农杆菌LBA4404菌株；含正确Ku70基因敲除载体的根癌农杆菌LBA4404菌株在含50μg/ml卡那霉素的LB平板上划线，在28℃下培养48h；挑取根癌农杆菌单菌落接种于含50μg/ml卡那霉素的基础培养基中，在28℃下，220r/min 培养48h；取1‑2ml菌液用诱导培养基稀释到吸光度为0.15，然后在28℃下，220 r/min诱导培养至OD600为0.45‑0.50；取100 μl诱导活化的根癌农杆菌菌液和100μl 1×106个/ml的分生孢子液混匀，涂布在共培养培养基平板上，在28℃下共培养48h；将融化的MYA固体培养基，MYA固体培养基含8 μg/ml的G418以及300μg/ml的氨苄青霉素，均匀倒在共培养平板上，在28℃下培养至出现抗性菌落；挑取转化子单菌落转接到含200μg/ml G418的固体培养基平板上，MYA培养基中NaCl的质量百分比为5%，在28℃下培养5天，然后收集转化子菌丝；步骤（4）：提取G418抗性转化子基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证，引物P14的序列为5’‑GCGAAGAGCCTCAGATTGC‑3’，引物P15的序列为5’‑GCCACTGCTTACCTTGTCTATC‑3’； 筛选出PCR产物为2611bp的转化子菌株，初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；筛选出PCR产物为2611bp的Ku70基因敲除突变菌株；步骤（5）制备初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株；的分生孢子，进行单孢分离；提取单孢分离后菌株的基因组DNA，用引物P14和P15进行PCR验证；PCR产物为2611bp的菌株初步鉴定为Ku70基因敲除突变菌株，提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切，然后电泳并进行southern blot验证；采用引物nptF和nptRV，以质粒pUR5750为模板，制备southern blot探针；采用CTAB法提取基因组DNA，分别用EcoRⅠ和SacⅠ酶切酶切基因组DNA，并进行琼脂糖凝胶电泳；EcoRⅠ和SacⅠ分别酶切基因组DNA的southern blot条带均为一条带，表明再次鉴定的Ku70基因敲除突变菌株为 Ku70基因敲除突变菌株。