[发明专利]一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法

摘要

本发明公开了一种促进精氨酸脱亚氨基酶（ADI）高效水溶性表达的方法。是将来源于恶臭假单胞杆菌的ADI基因连接pET-30a-c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a-ADI，并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；将工程菌接种于含有1-10g/L D-葡萄糖的LB培养基中，并添加L-阿拉伯糖培养；当菌体培养至对数期时，再添加1-10g/L的L-精氨酸及0.1mM IPTG，在16℃，180rpm条件下诱导培养实现。本发明方法可显著提高重组ADI蛋白的水溶性产量，粗酶液活性也提高了15倍，并有效克服了重组ADI难以可溶性表达的缺陷，为工业化大规模生产瓜氨酸等应用提供了技术支持，也为其他重组蛋白的表达提供了一个新思路。

主权项

一种促进精氨酸脱亚氨基酶高效水溶性表达的方法，步骤是：（1）将来源于恶臭假单胞杆菌（Pseudomonas putida）的精氨酸脱亚氨基酶（Argininedeiminase，ADI）基因连接至pET‑30a‑c(+)载体，构建重组表达质粒pET30a‑ADI，并与pGro7质粒共转化入E.coliBL21(DE3)中，获得含双质粒的工程菌；（2）将步骤（1）所述的含双质粒工程菌接种于LB培养基中，在37±1℃，200±10rpm条件下培养12‑18h；（3）在LB培养基中添加1‑10g/L的D‑葡萄糖制得LBG培养基，将步骤（2）培养后的菌液按体积比为1%的接种量接种于制得的LBG培养基中，再添加终浓度为0.2‑0.8g/L的L‑阿拉伯糖，在37±1℃，200±10rpm条件下培养；（4）当步骤（3）所述菌体培养至OD600=0.6‑0.8时，向培养液中添加终浓度为1‑10g/L的L‑精氨酸，和终浓度为0.1mM的IPTG，在16±1℃，180±10rpm条件下诱导培养24‑30h；（5）将步骤（4）培养后的菌液在4℃，8000rpm条件下离心10‑15min，弃上清，沉淀用体积比为10%的Tris‑NaCl缓冲液重悬，常规超声破碎，之后在4℃，12000rpm条件下离心30‑35min，分离出可溶性组分与不溶组分，可溶组分即为含有精氨酸脱亚氨基酶的粗酶液。