[发明专利]一种microRNA的超分支滚环扩增检测方法

摘要

本发明提供一种microRNA的超分支滚环扩增检测方法。该方法包括以下步骤：设计一条颈环结构的逆转录引物，一条锁式探针和一对分支滚环扩增反应（HRCA）的扩增引物；建立逆转录反应体系，用于microRNA的逆转录反应；建立锁式探针的连接体系，用于锁式探针的连接反应；建立超分支滚环扩增反应体系，用于以环化的锁式探针为模板的超分支滚环扩增反应；配置2%的琼脂糖凝胶，用于扩增产物的检测。该方法通过扩增产物电泳后在琼脂糖凝胶上是否呈阶梯状条带来判断目标microRNA的有无，具有较高的灵敏度、特异度和准确度，并且操作简单，无需昂贵的检测仪器，适合临床推广。

主权项

一种microRNA的超分支滚环扩增检测方法，其特征在于，包括以下步骤：1）逆转录引物的设计：逆转录引物是按照与靶microRNA碱基互补配对的原则所设计，使其3’端末尾6个碱基与靶microRNA3’端末尾6个碱基互补配对，并形成一种颈环结构；2）锁式探针的设计：锁式探针以cDNA序列中的一段连续排列的碱基作为识别序列，其中5’端为15个碱基，3’端为25个碱基，5’端磷酸化；3）根据锁式探针的序列设计一对扩增引物CF1、CF2；4）逆转录反应体系的建立：包含microRNA、逆转录引物、dNTPs、10×RT缓冲液、RNA酶抑制剂、逆转录酶、DEPC H2O；5）锁式探针连接体系的建立：包含步骤4）形成的逆转录产物、锁式探针、TaqDNA连接酶、10×Taq DNA连接酶缓冲液、ddH2O；6)超分支滚环扩增反应体系的建立：包含步骤5）形成的连接产物、dNTPs、CF2引物、Bst DNA聚合酶、10×Bst DNA聚合酶缓冲液、ddH2O；7）超分支滚环扩增反应产物的检测：取步骤6）形成的扩增产物于2%的琼脂糖凝胶上电泳观察电泳条带，若呈阶梯状分布，则该方法被成功建立。