[发明专利]多级PCR检测病原体的方法和试剂盒

摘要

本发明公开了多级PCR检测病原体的方法和试剂盒。本发明方法通过在全封闭体系中，用两对或多对所述病原体特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的病原体的核酸物质，并通过测序等方法准确地确定病原体的种类或型别。本发明方法实现了在全封闭体系内、可简便地在多级PCR过程中对各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，从而根本上消除了PCR的交叉干扰，使作为临床检测的极度灵敏的、但却又无法广泛实际应用的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

主权项

一种非诊断且非治疗性地鉴别病原体种类或型别的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第i+1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi+1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次；(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i+1扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得扩增产物的序列；和(e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的种类或型别；且在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放置有可携带PCR扩增产物的固体颗粒，从而在PCR反应过程中或之后，形成携带PCR扩增产物的固体颗粒；其中，该过程在多级PCR反应管中进行，所述反应管由二个或多个可封闭的PCR反应腔或隔室(10)，以及在至少两个隔室之间设有的封闭的或可封闭的连接通道(40)所组成，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒(50)从上游隔室转移至下游隔室；且所述的隔室具有腔盖，并且对于相互连通的多个隔室而言，当各自的腔盖全部盖上后，就构成一个封闭空间，并且所述腔盖为密封盖；且在多级PCR反应开始至多级PCR反应结束期间，整个所述的多级PCR反应管处于完全封闭状态；在步骤(b)和(c)中，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j+1级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室都处于封闭状态，其中j为≥1的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j+1级PCR隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从Pj级隔室转移至Pj+1级隔室。