[发明专利]一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法

摘要

一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，属于大肠杆菌表达调控领域。本发明利用基因工程技术，以细菌来源的普鲁兰酶为表达蛋白，构建了表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。通过使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET-22b(+)和pET-28a(+)，构建了重组菌E.coliBL21/pET-22b(+)-pul和E.coliBL21/pET-28a(+)-PelB-pul，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，基本消除了毒性外源蛋白的本底表达，提高了冷冻甘油菌种的表达稳定性和乳糖自诱导后的目标蛋白表达量，增强了大肠杆菌表达系统稳定性。本发明解决了大肠杆菌T7表达系统中常见的系统稳定性问题，开发了增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法。

主权项

一种基于双阻遏策略增强大肠杆菌T7表达系统稳定性的方法，其特征在于：以来源于长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC M 2012388的普鲁兰酶为表达蛋白，使用含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的pET表达载体pET‑22b(+)及pET‑28a(+)，利用lac操纵子严谨的双阻遏调控策略，构建了重组菌E.coliBL21/pET‑22b(+)‑pul及E.coliBL21/pET‑28a(+)‑PelB‑ pul，作为对照，构建了不含有lac操纵子和阻遏物基因lacI的表达系统E.coli BL21(DE3)/ pET‑20b(+)‑pul；步骤为：   （1）普鲁兰酶基因的获得长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC M 2012388培养基：CaCl2 0.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，（NH4）2SO4 0.2 g/L，酵母提取物 2 g/L，无水葡萄糖 5 g/L，KH2PO4 3 g/L，无机盐溶液1 mL/L，pH 5.0，双蒸水配制；无机盐溶液：ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，MnCl2·H2O 0.03 g/L，H3BO3 0.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，CuCl2·2H2O 0.01 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.03 g/L，双蒸水配制；将长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）CCTCC M 2012388菌种接种于含有25 mL培养基的250 mL摇瓶中，于37℃、200 rpm振荡培养72 小时，培养结束后，将菌体离心并用生理盐水洗涤两次，收集细胞利用VIOGENE公司的基因组DNA提取试剂盒Genomic DNA Extraction Miniprep System提取基因组；引物1：5’‑ gaa caG GAT CCa gat ggg aac acc aca aaC ‑3’，引物2：5’‑ att ccc tcg agt tta cca tca gat ggg ct ‑3’；引物1含有BamHI限制性酶切位点，引物2含有XhoI限制性酶切位点；PCR反应体系：ddH2O 37 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，25 mmol/L 的dNTP 0.5 μL，50 pmol/μL的引物1 1 μL，50 pmol/μL的引物2 1 μL，基因组DNA 5 μL，5 U/μL的 Taq DNA polymerase 0.5 μL；以长野芽孢杆菌CCTCC M 2012388基因组为模板，采用PCR方法扩增普鲁兰酶基因，PCR反应过程：95℃预变性5 min；95℃ 1 min、60℃ 0.5 min、72℃ 2 min，进行30个循环；72℃延伸10 min；利用上海申能博彩生物科技有限公司的3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit纯化DNA片断；DNA溶液中加入1/10体积的pH 5.2、3 mol/L的乙酸钠溶液和2倍体积无水乙醇，‑20℃沉淀1小时，12000 rpm于4℃离心30 min，加入75%乙醇500 μL洗涤，12000 rpm于4℃离心30 min，无菌操作台吹干后溶于适量TE缓冲液中，立即使用或‑20℃保存；（2）含有普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌的构建a、pET‑20b(+)‑pul的构建利用北京博大泰克生物基因技术有限公司的质粒提取试剂盒Mini‑Plasmid Rapid Isolation Kit提取质粒pET‑20b(+)；按照水、缓冲液、PCR产物或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒钟使液体集中于管底，37℃水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10分钟，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，BamHI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL；目的基因与质粒pET‑20b(+)的连接将普鲁兰酶基因与质粒pET‑20b(+)连接，反应体系组成如下：质粒pET‑20b(+) 0.8 μL，普鲁兰酶基因4.2 μL，Ligation Solution 5 μL；混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12小时；重组质粒转化大肠杆菌在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟，转入42℃水浴中，热击90秒，快速转移至冰浴中，冷却2分钟，加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1小时，培养后菌液3000 rpm离心2分钟，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 氨苄抗生素的LB平板上，37℃倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)/pET‑20b(+)‑pul；b、pET‑22b(+)‑pul和pET‑28a(+)‑PelB‑ pul的构建将重组质粒pET‑20b(+)‑pul和表达载体pET‑28a(+)、pET‑22b(+)分别用限制性内切酶XbaI和XhoI分步单酶切，按照水、缓冲液、质粒、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2秒使液体集中于管底，37℃水浴3小时，在管中加入1/10体积的Loading Buffer或将管置于65℃保温10分钟，终止酶切反应，酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收目的片段，浓缩；反应体系组成：10×H Buffer 4 μL，DNA 10 μL，XbaI 2 μL，XhoI 2 μL，ddH2O将体系补足40 μL；将胶回收线性化的目标片段分别与pET‑28a(+)及pET‑22b(+)载体连接，反应体系组成如下：质粒载体1 μL，目标片段4 μL，Ligation Solution 5 μL，混合连接液，将其置于16℃培养箱中连接反应12小时；重组质粒转化大肠杆菌在100 μL大肠杆菌E. coli BL21(DE3)感受态细胞悬液中加入10 μL连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置30分钟，转入42℃水浴中，热击90秒：快速转移至冰浴中，冷却2分钟；加入700 μL的LB液体培养基，37℃、100 rpm摇床温育培养1小时，培养后菌液3000 rpm离心2分钟，弃上清600 μL，剩余菌液混匀后涂布到含有50 μg/mL 卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养，获得含有目的普鲁兰酶基因的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/pET‑28a(+)‑PelB‑pul及E. coli BL21 (DE3)/pET‑22b(+)‑pul；双阻遏效应基本上消除了重组大肠杆菌的本底表达现象，重组大肠杆菌冷冻甘油管的表达显示双阻遏效应可维持表达系统的稳定性，及重组大肠杆菌自诱导表达的稳定性得到提高。