[发明专利]一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法

摘要

本发明公开了抗黑条矮缩病水稻的培育方法，通过构建含有水稻黑条矮缩病病毒基因组S7部分片段的RNAi植物表达载体，利用农杆菌介导的转基因方法将目的片断导入水稻的胚性愈伤组织，通过潮霉素抗性筛选、分化，获得再生转基因植株，并通过对经接虫传毒试验的转基因植株中病毒基因的表达分析表明，转基因水稻植株中病毒基因的表达明显降低。该方法利用RNAi技术，可培育出对黑条矮缩病表现抗性的水稻转基因株系，从根本上解决水稻黑条矮缩病缺少抗源的问题，显著增强水稻对该病的抗性，提高经济效益。

主权项

一种抗黑条矮缩病水稻的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：A.RNAi载体构建A1.目的片段的选择与获得提取水稻黑条矮缩病病叶中的总RNA，并通过反转录得到其cDNA，通过在NCBI数据库中作同源比对，选定水稻黑条矮缩病病毒基因组S7‑1中441bp特异序列作为构建RNAi载体的目的片段，通过设计含有特定酶切位点的特异引物S7‑F和S7‑R将该段序列扩增出来，电泳后利用胶回收试剂盒回收目的片段，加入polyA后克隆到pMD18‑T载体上，在经过测序确认无误后，用于步骤A2中的载体构建；A2.目的片段RNA干扰结构的构建用BamHI和SpeI双酶切含有目的片段的pMD18‑T质粒，同时用XbaI和Bg1II双酶切中间载体p1022RNAi，酶切产物经电泳后，回收目的片段和切开的载体p1022RNAi，通过T4连接酶将两者连接起来，并导入大肠杆菌DH5α中，经双酶切鉴定后挑取阳性克隆，挑选的阳性克隆质粒再次经过双酶切，随后与之前回收过的目的片段再次相连后，同样导入大肠杆菌DH5α中扩增并酶切鉴定，获得目的片段RNA干扰结构；A3.干扰结构连入植物表达载体步骤A2中鉴定正确的阳性克隆再经过BamHI和SacI双酶切后，回收含有目的片段RNA干扰结构的片断，与经过同样双酶切的经过改造的植物表达载体pCAMBIA1301相连，导入大肠杆菌后通过双酶切鉴定阳性克隆，最终获得了S7的RNA干扰结构的超双元植物表达载体S7‑RNAi：B.转基因水稻植株的获得R1.以抗条武育粳3号的成熟种子在N6D2培养基上诱导出愈伤组织，用农杆菌EHA105／S7‑RNAi侵染愈伤组织，随后置于共培养基N6D2C上共培养3天，再经分别含有25mg／L和50mg／L潮霉素的筛选培养基上各筛选10～15天，筛选获得较多的抗性愈伤组织；B2.将抗性愈伤组织再经过10～15天预分化培养，之后再经过分化培养得到小苗，待小苗长势良好后转入生根壮苗培养基上生根壮苗，最终获得了32个独立转化系，将获得的转基因植株移栽入大田中。