[发明专利]一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用

摘要

一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法及应用，属于酶制剂、酿酒添加剂技术领域。本发明涉及将从普罗威登斯菌（Providenciasp.）JNB815中提取的具有降解尿素和氨基甲酸乙酯(EC)活性的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化双功能酶。该固化酶以尿素为底物时，最适温度为40℃，最适pH为4.0；以EC为底物时，最适温度60℃，最适pH为4.5。两种酶活的贮存半衰期分别为54d及45d。本发明还涉及这种固定化双功能酶的应用：尿素去除率可达93.03%，EC去除率为56.60%。本发明可以不改变原酿造酒的工艺条件，不改变酒的风味，且固定化双功能酶可以重复利用，在去除黄酒中微量尿素和EC的应用中具有更多的优势。

主权项

一种天然材料复合体系固定化酒用双功能酶的制备方法，其特征在于将从普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815菌体细胞破碎液中提取的游离双功能酶，经壳聚糖吸附、明胶包埋和京尼平交联，得固定化酒用双功能酶；工艺为：A．游离酶提取：（1）菌种：采用普罗威登斯菌（Providencia sp.）JNB815，本实验室筛选，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：CGMCC No.8326；（2）游离酶的提取：菌种经过种子培养和发酵培养获得一定量菌体，将发酵液4℃、8000rpm离心5 min后，弃上清，所得菌体用去离子水洗涤两次，pH4.5的柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液洗涤一次，离心获得全细胞；将获得的全细胞用柠檬酸‑柠檬酸钠缓冲液稀释到原发酵液体积的1/10，重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎，超声波破碎条件为300 W、15min，破碎时间3 s、间隔时间3 s，处理量35 mL；破碎液在4℃、10000 rpm离心20 min，收集上清液，即为游离酶酶液；B．固定化过程：（3）称取壳聚糖3~5 g、明胶1~3 g，溶于100 mL 1%的乙酸中，置于磁力搅拌器上搅拌均匀后，超声脱泡；取质量浓度20%的NaOH溶液和无水乙醇按4:1的体积比混合均匀制成200‑300 mL凝结液；用注射器将壳聚糖和明胶混合溶液滴入凝结液中，形成直径3‑4 mm的微球，凝结一段时间后用去离子水洗涤壳聚糖微球至中性，滤干；（4）将步骤（3）所得壳聚糖微球在30℃恒温水浴震荡的条件下，与质量浓度0.4%的京尼平溶液进行交联，壳聚糖微球︰京尼平溶液的比g/mL计为1︰5，交联时间为6h，洗涤除去游离的京尼平溶液；活化后的微球与步骤A中的游离酶酶液在4℃冰箱中静置8h进行固定，每g微球加入2.5 mL酶液；最后，吸出未固定的游离酶酶液，并洗涤微球至表面无游离酶为止，所得固定化酶贮存在4℃冰箱中，备用。