[发明专利]一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法

摘要

本发明公开了一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆及功能表达方法，通过材料的准备与处理、RNA的提取和cDNA的合成、使用RT-PCR进行克隆合成出了逆境胁迫AhROLP1基因，该基因开放阅读框为1620bp，共编码540个氨基酸；基因氨基酸序列与与鹰嘴豆、大豆、野草莓、葡萄、番茄等植物的牛心果碱氧化酶同源性均达到了70%以上。通过荧光定量PCR验证了AhROLP1在低温，盐胁迫和干旱胁迫下的表达模式，结果表明该基因在三种非生物逆境胁迫下转录水平均有明显升高，并且此后一直维持在较高的水平。将该基因通过转基因手段导入拟南芥中，转基因植株比对照具有明显的耐冷、耐盐和抗旱特性。

主权项

一种花生逆境胁迫AhROLP1基因的克隆方法，其特征在于，主要包括以下步骤：（1）材料的准备与处理：材料选择花生花育33，花生种子在营养土和蛭石以2：1混合的土中萌发，萌发后幼苗生长条件为16h光照/8h黑暗，温度为22‑28℃，生长约2周处于三叶期的花生幼苗用于后续的非生物胁迫处理；材料的低温处理，将三叶期花生幼苗置于4℃光照培养箱中进行处理，取处理时间分别为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h的花生叶片和根作为材料；对于耐盐用NaCl处理；对于抗旱，用PEG6000处理；将花生从土中取出并小心将根上的土用水冲洗干净，然后将花生根分别浸泡在200mMNaCl或重量浓度20%PEG6000溶液中，在处理时间为0h，1h，3h，6h，12h，24h，48h和72h分别取花生的叶片和根作为材料，所有材料均保存于‑80℃超低温冰箱中备用；（2）RNA的提取和cDNA的合成按照试剂盒操作手册的方法用天根的RNeasyMiniKit分离提取花生幼苗RNA，RQ1 RNase‑free DNaseI将得到的RNA去除DNA污染后再进行cDNA的合成，用M‑MLV Reverse Transcriptase进行cDNA的合成，25‑μL反应体系中包含2μgRNA，在42℃条件下经过60min的反转录反应后将反转录产物置于冰上放置5min，之后将反转录产物于‑20℃低温冰箱中保存备用；（3）基因克隆通过RT‑PCR进行克隆，PCR扩增所用的聚合酶为LA TaqTM DNA polymerase，在25‑μL体系中加入以下成分：含MgCl2的2.5μL 10×PCRbuffer；2.5μL 10mMdNTPs；1μL cDNA模板；0.5μL LA polymerase和17.5μL ddH2O。PCR反应条件为：(a)94℃，5min；(b)94℃，45s；55℃，45s；72℃，90s；共35cycles；(c)72℃，10min；扩增基因全长所用引物为AhROLP1‑S:5’‑TTTGTCAAAAATTAATATACCAAAA‑3’和AhROLP1‑A:5’‑TAATTTTGAATGATGATTACCC‑3’；PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳分离后用胶回收试剂盒进行纯化，纯化产物连接pMD18‑TEasy vector并测序。