[发明专利]棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法

摘要

本发明涉及一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达影响的研究方法，属于生物技术领域。其具体方法和步骤如下：(1)分离和培养淋巴细胞；(2)提取总RNA；(3)合成cDNA；(4)cDNA的纯化；(5)设计引物；(6)生成标准曲线；(7)根据2^-△△CT法分析棉酚作用后的IL-18基因的表达；(8)分析研究不同浓度、不同时间下棉酚作用后表达量变化。该发明较好地分析研究了棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL-18基因表达的影响，并能以此作为解除棉酚对新疆多浪羊危害方面研究的重要依据。

主权项

一种棉酚对新疆多浪羊淋巴细胞IL‑18基因表达影响的研究方法，其特征在于：该方法的具体骤如下：(1)分离和培养淋巴细胞：采集健康成年多浪羊新鲜抗凝血与Hank′s液等比例混匀，然后加一定体积的人淋巴细胞分离液，以2000g／min的离心速度离心20min后，得到淋巴细胞，然后将淋巴细胞悬浮于RPMI1640中混匀，分别于细胞培养瓶中加入棉酚，使终浓度为(5μmol／L、10μmol／L、15μmol／L、20μmol／L、25μmol／L、30μmol／L、35μmol／L)于37℃、CO₂培养箱(5％CO₂)中培养；(2)提取总RNA：采用Trizol法提取多浪羊外周血淋巴细胞的总RNA；不同浓度、不同时间棉酚作用的淋巴细胞培养液1mL／管分装，以2000g／min，离心15min中后弃上清，加入1mLTrizol后充分混匀，室温静置5‑10min裂解，然后加入200μL氯仿，涡旋15s，静置2min，再以12000g离心15min，加500μL异丙醇，放在15‑30℃的环境中孵育10min后，12000g离心10min，弃去上清，加入1mL的75％乙醇，涡旋混匀，4℃，7500g离心5min，弃去上清液，室温或真空干燥5～10min，然后将RNA溶于20μL的DEPC水中，55～60℃水浴10min，于‑70℃保存，通过琼脂糖凝胶电泳对所提取的总RNA进行检测，并用核酸测定仪测定其浓度和纯度；(3)合成cDNA：将检测好的总RNA取出，放于冰盒中，去16μL总RNA为模板，加入dNTP2μL，Oligod(T)2μL，混合后于65℃温浴5min后，置冰上2min，瞬时离心10s，然后再依次加入5×Primerscript buffer8μL，RNAse Inhibitor1μL，Primerscript RTrase2μL，RNAsefree H₂O9μL，总计40μL的反应体系，放入42℃水浴锅孵育45min，再放入70℃水浴锅，15min，保存于‑20℃冰箱备用；(4)cDNA的纯化：采用QIAquick PCR Purification Kit进行cDNA的纯化；(5)设计引物：用引物设计软件oligo6.0对多浪羊IL‑18基因进行引物设计，可以同时用primier5.0引物设计软件对所设计引物的扩增效率进行分析，挑选最优引物；(6)生成标准曲线：将纯化后的cDNA按原倍、2倍、4倍、8倍、16倍、32倍的浓度梯度稀释，使用QuantiTect SYBR GEEN试剂(Qiagen)进行Real‑time PCR(Real‑time PCR仪‑Light Cycler480)生成IL‑18基因的标准曲线；以β‑Actin基因作为参照，对棉酚作用后多浪羊淋巴细胞中IL‑18基因的表达量的变化；反应体系如下：QuantiTect SYBR GEEN Master10μL、H₂O6μL、上下游引物各1μL，cDNA2μL；(7)根据2^‑△△CT法分析棉酚作用后的IL‑18基因的表达：根据2^‑△△CT来确定棉酚作用后的IL‑18基因与未经棉酚作用的IL‑18基因扩增曲线的差异及CT值的差异，确定棉酚对多浪羊淋巴细胞的影响；(8)分析研究不同浓度、不同时间棉酚作用后多浪羊淋巴细胞IL‑18基因的表达量变化：用EXCEL表格进行分析，确定在不同棉酚浓度和作用时间下，最高的表达量，通过表达量来对比分析棉酚对多浪羊淋巴细胞IL‑18基因表达的作用临界点。