[发明专利]西洋参发状根诱导及植株再生研究方法

摘要

本发明涉及一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，属于作物生物技术领域。该方法包括以下步骤：(1)外植体处理；(2)菌种保存、活化及培养；(3)西洋参发状根诱导条件的优化；(4)西洋参发状根的获得与鉴定；(5)西洋参发状根液体培养生长量与总皂苷含量的测定：(6)西洋参发状根再生体系的建立及条件优化。本发明以西洋参的发状根为材料通过胚状体发生途径诱导再生植株，为西洋参的育种开辟了一个新方向。采用Ri质粒可以更简单、方便地将外源基因导入；另外由发状根获得的再生植株本身即为转基因植株，使转基因植株具有很容易生根的特点，可以较好地解决植株再生面临的根的分化难，或者生长能力弱和形成的根数量少难题。

主权项

1.一种西洋参发状根诱导及植株再生研究方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)外植体处理：(I)西洋参种子萌发及处理：经过沙藏层积处理，已经裂口的种子，播种到栽培盘中，遮荫培养，待播种1～2周苗长出后，用0.1％升汞消毒6min，无菌水清洗4～5次；将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，接于MS固体培养基上预培养用作转化的起始材料；(II)西洋参一年、二年生根的处理：将西洋参一年、二年生根表面用清水清洗干净后，流水冲洗3～4h，用0.1％升汞消毒10min～20min后，无菌水洗5遍，切成0.2cm厚的薄片放在MS固体培养基上待用；(2)菌种保存、活化及培养：发根农杆菌的长期保存方法是将农杆菌菌种溶于甘油中，于-20℃条件下保存；短期保存的方法是将发根农杆菌接种于YEB固体培养基上培养，当长出菌斑后，于4℃冰箱中保存；无菌条件下，用接种针挑取保存的菌液，于YEB固体平板上划线，28℃置于黑暗条件下培养，直到长出明显的单菌落；然后挑取一个单菌落接种于50mL液体YEB培养基中，120r/min、28℃、暗条件下培养24h，此时YEB液体培养基由接种前的透明的红棕色变成浑浊的淡黄色，证明细菌已正常长出；取1mL已活化的菌液加入50mL的YEB液体培养基中，120r/min，28℃暗条件下培养，活化菌液达到生长对数期时，此时的菌液就可以作为感染用；(3)西洋参发状根诱导条件的优化：(3a)不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响：选择发根农杆菌R1601、8196、A4、rolA四个菌种经平板活化培养后接入YEB液体培养基中，待其菌液生长浓度达到OD₆₀₀=0.6时用于侵染用；2～3周苗龄的西洋参实生苗，选择生长良好幼嫩的，将其叶片、带叶幼茎和茎段切成1.0cm的切段，在无25±1℃摇床100～120r/min侵染10～30min，无菌条件下取出；灭菌滤纸吸干材料表面菌液，接于MS培养基上，考察不同菌种对西洋参发状根诱导率的影响；(3b)菌液浓度对西洋参发状根诱导率的影响：制备好的R1601菌液用YEB液稀释至OD₆₀₀值为0.2、0.4、0.6、0.8和1.0，将西洋参实生苗外植体投入不同浓度的菌液中浸染15～30min，25±1℃摇床100～120r/min，然后取出用无菌滤纸吸干表面的菌液，在共培养基上培养2d后，再转接到MS共培养培养基上，每隔7d换一次培养基；(3c)AS与侵染时间对西洋参发状根诱导率的影响：挑取的单菌落接种于添加AS的50mL YEB液体培养基中活化，AS浓度选为0、100μmol/L振荡培养，待其光密度值为0.6时将西洋参实生苗的组织段浸入，侵染时间选为10min、15min、20min、25min和30min：(3d)不同外植体对西洋参发状根诱导率的影响：选择外植体为2～3周苗龄西洋参实生苗的叶片、茎段、叶柄和西洋参愈伤组织、一年、二年生西洋参根，选择菌种为发根农杆菌R1601，考察西洋参外植体的选择对发状根诱导率的影响；其中叶片、茎段、叶柄为叶盘法，浸染时间为15～30min，西洋参愈伤组织、西洋参一年、二年生根为滴加法；(3e)NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响：在预培养的MS基本培养基中添加一定量的NAA有益于发状根的诱导；以2～3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度；(3f)预培养时间对西洋参发状根诱导率的影响：选择MS+NAA2.0mg/L固体培养基为预培养基质，选择2～3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养时间选为0h、12h、24h、48h、72h、96h，以考察预培养时间对西洋参发状根诱导率；(3g)NAA浓度对西洋参发状根诱导率的影响：以2～3周西洋参实生苗的叶柄为材料，MS基本培养基中添加NAA的浓度选择分为0mg/L、2mg/L、4mg/L、6mg/L，比较发状根诱导率以考察NAA最适浓度；(3h)共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响：选择共培养时间为12h、24h、36h、48h，共培养培养基选为MS；以2～3周西洋参实生苗的茎段为材料，预培养培养基为MS+NAA2.0mg/L时间为48h，菌种为R1601，以考察基质与共培养时间对西洋参发状根诱导率的影响；(3i)头孢霉素(Cef)浓度对抑菌和西洋参发状根诱导率的影响：头孢霉素(Cef)的浓度选择为200mg/L、300mg/L、400mg/L、500mg/L、600mg/L，除菌基质选择为MS基本固体培养基；综合比较抑菌效果、污染率、获得发根数三项指标，考察头孢霉素(Cef)的最优浓度；(4)西洋参发状根的获得与鉴定：(4a)西洋参发根的获得：①外植体预培养：西洋参实生苗消毒后，将其叶片切成1.0cm×1.0cm的小块，叶柄、和茎段切成1.0cm长的段，西洋参一年、二年生根流水冲洗去表面浮土，经升汞消毒后蒸馏水3～5遍冲洗干净，视材料厚度切成0.2～0.5cm薄片，将以上所有材料接MS+NAA2mg/L培养基中黑暗条件下培养48h用于侵染；②侵染与共培养：在超净无菌工作台上，将预培养的外植体材料，转移到装有准备好菌液的三角瓶中，封口后放在120r/min，黑暗条件下的摇床上感染10～30min，感染后的外植体用无菌滤纸吸干材料表面菌液，接种到MS固体培养基中，于黑暗、25℃条件下共培养48h；③除菌培养：将共培养后的感染外植体材料用无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干外植体材料表面的无菌水，将其转接到含有头孢霉素(Cef)500mg/L的MS固体培养基上培养，于黑暗、25℃条件下除菌培养；(4b)西洋参愈伤与一年、二年生根发状根的诱导：用微量移液枪吸取活化的发根农杆菌菌株8μL滴到已接到MS固体培养基的西洋参愈伤组织切面与西洋参根切片上；操作过程中避免菌液滴到MS固体培养基上，把滴加菌液的材料放在25℃，黑暗条件下的培养箱中培养；15d后除去褐化死亡的材料，将其余的材料转移到新鲜的MS固体培养基上继续培养；(4c)PCR分子检测：通过PCR方法对Ri质粒T_L-DNA的rolC基因检测将进一步提供分子生物学的依据，具体过程如下：①引物设计及合成：设计引物1和引物2：引物1：5′-GATATATGCCAAATTTACACTAG-3′；引物2：5′-GTTAACAAAGTAGGAAACAGG-3′；利用以上两个引物通过PCR扩增到T-DNA上rolC基因片段，预期长度是564bp；②CTAB法提取西洋参发状根总DNA；③提取发根农杆菌的Ri质粒；④PCR循环参数：⑤PCR反应体系：超纯水定容至25μl：⑥琼脂糖凝胶电泳，拍照；(5)西洋参发状根液体培养生长量与总皂苷含量的测定：发状根液体培养采用MS液体培养基为基本培养基(3％蔗糖，pH值5.8～6.0)，将12条生长旺盛的约2cm的发状根根尖接入装有30mL MS液体培养基中，温度为24±1℃，摇床转速100r/min，每隔3d取样，测定发状根干重及总皂苷的含量，测定一个月；所有数据为3瓶的平均值，重复两次；采用标准曲线法对发状根中总皂苷的测定：标准曲线的绘制步骤为：①取Rg10.020g溶于甲醇中，定容为2mg/mL；②取Rg1对照品溶液30、60、90、120、150μL；③分别置于5支试管中(10mL，具塞)，甲醇定容为150μL，以相应试剂作对照；④将试管置于冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％硫酸摇匀，60℃恒温水浴20min；⑤冰水浴15min后在755B分光光度仪544nm处检测，以人参为标准品比色测定，根据标准曲线Y=503.29X+4.456，R²=0.9924求得样品皂苷含量(％)；发状根中总皂苷的测定取液体培养的新鲜发状根，蒸馏水冲洗后，用滤纸吸干发状根表面的水分，称量发状根鲜重；然后于真空干燥箱中80℃下干燥至恒重，称量，将干燥后的发状根粉碎，放入三角瓶中，加入一定量的浓度为40％的乙醇溶剂，并将三角瓶口用封口膜密封；置于超声发生器中进行分离提取，提取时间15min，超声频率为28KHz，提取两次；在冰水浴中加5％香草醛醇溶液和72％H₂SO₄染色，60℃恒温水浴10min，冰水浴15min，于544nm处测吸光度；(6)西洋参发状根再生体系的建立及条件优化：(6a)西洋参发状根愈伤组织的诱导：以西洋参发状根为外植体，接到添加不同浓度，不同组合的2，4-D、BA、KT等生长调节剂的MS培养基上，其中蔗糖浓度为30g/L，琼脂含量为6.5g/L，pH值是6.0(灭菌前)，培养基的灭菌压力为0.1MP持续15～20min，放到不同光照条件下，光照周期为12h/d，温度为24±1℃，两周后统计愈伤组织发生率(发生愈伤组织的外植体数/外植体总数)分析不同生长调节剂与光照条件对愈伤组织诱导的影响，筛选最佳调节物质及浓度和光照条件；(6b)西洋参发状根胚状体的发生：不同激素组合、浓度与光照对胚状体发生和生长的影响分别取不同浓度及组合的2，4-D、KT、BA对培养物进行处理，分析各激素对胚状体发生和生长的影响，筛选出胚状体发生及生长的最优培养基配方；取黑暗、光照条件下培养，观察光照条件对培养物的影响；光照由日光灯提供(约1200Lx)，光周期为12h/d。