[发明专利]甘草酸酶联免疫检测技术

摘要

本发明提供了一种甘草酸酶联免疫检测技术，它涉及微量免疫检测技术领域，它采用鼠源单克隆抗体技术，主要步骤包括：免疫原与包被原的合成与鉴定；进行动物免疫；制备杂交瘤细胞：取准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，应用间接ELISA和间接竞争ELISA方法进行筛选鉴定；抗甘草酸单克隆抗体制备；甘草酸单克隆抗体的初步鉴定；它可对来源复杂的甘草及其相关产品进行快速、简单、准确的检测，判断甘草原料药中活性成分的有无。

主权项

甘草酸酶联免疫检测技术，其特征在于它采用鼠源单克隆抗体技术，主要步骤包括：(1)、免疫原与包被原的合成与鉴定：采用活性酯发分别了免疫抗原和包被抗原，采用紫外扫描法检测合成抗原的性质；(2)、进行动物免疫：用合成的免疫原GA‑KLH免疫Blab/c小鼠，通过3次加强免疫后断尾取血，血清效价均大于1∶16000，经过融合，筛选出阳性细胞株，经过三次亚克隆化后阳性率达100％，获得能稳定分泌甘草酸单克隆抗体的杂交细胞株，将其命名为3D6，经过7代培养，细胞的生长状态良好，表明该细胞稳定性良好，可以用来稳定生产甘草酸单克隆抗体；(3)、制备杂交瘤细胞：取准备好的脾细胞与骨髓瘤细胞融合后，应用间接ELISA和间接竞争ELISA方法进行筛选鉴定，阳性抑制满足要求的细胞株，进行亚克隆，获得大量杂交瘤细胞；(4)、抗甘草酸单克隆抗体制备：取雌性小鼠5只，腹腔注射无菌液体石蜡0.5～1mL，7～10d后腹腔注射杂交瘤细胞1～5×106pfu/只，8～13d后待小鼠腹部明显膨大后采集腹水，待3～4d腹水再次积聚后，同法收集腹水；(5)、甘草酸单克隆抗体的初步鉴定：通过间接竞争ELISA测定抗体的抑制效果，甘草酸标准品用PBS按0、1、3、9、27、81μg/L稀释成5个浓度梯度，用已建立的间接竞争ELISA所测A值计算各浓度的抑制率。