[发明专利]一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法

摘要

本发明涉及免疫检测技术领域，提供了一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，包括制备抗体标被；对BDNF板和Prolaction板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；配制标准稀释液，作为空白液；配制样本稀释液；将BDNF板和Prolaction板放入孵育振荡器中孵育抗体；加入检测抗体后加入试剂盒SA‑HRP中；放在酶标仪下读取光密度OD值；绘制BDNF和prolactin的回收率标准曲线并测算稀释样品的回收率。本发明有效解决了背景值偏高，信噪比低，灵敏度低，并且具有降低基质效应所产生的干扰，使检测结果更加稳定可靠的特点。

主权项

一种ELISA用的抗原标准品和样本稀释液的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：第一步，制备抗体包被；将捕获的脑源性神经营养因子抗体加入碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为BNDF板，置于2‑8℃的温度下包被16‑24小时；进一步地，将催乳素抗体加入另一组碳酸盐缓冲液中，并且将其加入ELISA板的孔中，标记为催乳素板，置于2‑8℃的温度下包被16‑24个小时；第二步，对第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别进行浇注、封闭、洗涤、晾干后，再保存起来待用；将PH值为7.4±0.2的含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液向第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别浇注；或者将PH值为7.4±0.2的含有5‑10％脱脂奶粉向第一步中的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别浇注；进一步地，将该浇注好的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别放在2‑8℃的温度下封闭放置16‑24小时；进一步地，用含有非离子型表面活性剂的PBS溶液对封闭好的脑源性神经营养因子板和催乳素板进行洗涤、晾干后，置于2‑8℃的温度下保存待用；第三步，配制标准稀释液，作为空白液；首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂，搅拌均匀后作为标准稀释液，即空白液；第四步，配制样本稀释液；样本稀释液1：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％表面活性剂3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液2：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步的，向该溶液中加入5mmol/l的螯合剂乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液3：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.05％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液4：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.10％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液5：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.15％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液6：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.20％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；样本稀释液7：首先将0.05％聚氧乙烯山梨醇单月桂酸单脂加入含有5％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲液中，并且搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.2％的3‑[3‑(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入5mmol/l的乙二胺四乙酸搅拌均匀；进一步地，向该溶液中加入0.25％牛血清γ球蛋白；进一步地，向该溶液中加入百万分之十五的液体防腐剂搅拌均匀；第五步，将脑源性神经营养因子板和催乳素板放入孵育振荡器中孵育抗体；分别将第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1‑7、一份正常人血清样本，重复的分别加入第二步中晾干后待用的脑源性神经营养因子板和催乳素板的孔中，再向各个反应孔中加入处理酶，进一步地，将加好溶液的脑源性神经营养因子板和催乳素板放入孵育振荡器中，在18‑25℃的室温条件下反应；第六步，加入检测抗体；用含有Tween20的PBS作为洗液，对第五步中反应后的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别洗涤，再相应的向BDNF板的每个反应孔中加入脑源性神经营养因子检测抗体，并且相应的向催乳素板的每个反应孔中加入催乳素检测抗体；第七步，将稀释液加入试剂盒中；用含有Tween20的PBS作为洗液，对第六步中反应后的脑源性神经营养因子板和催乳素板分别洗涤后对其进行稀释，再分别向该试剂盒中的每个孔中加入稀释后的溶液；第八步，放在酶标仪下读取光密度值；用含有Tween20的PBS作为洗液，对第七步中反应后的试剂盒分别洗涤，再向该洗涤好的试剂盒中加入四甲基联苯胺底物；进一步地，将加好TMB的试剂盒放在酶标仪下读取光密度值；第九步，根据光密度值计算出非特异性吸附数据，通过比较非特异性吸附数据，进一步确定出牛血清γ球蛋白作为抗原对降低背景噪音具有直接并且积极的作用；首先，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1‑7、一份正常人血清样本，在脑源性神经营养因子板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；进一步地，第三步中的标准稀释液、第四步中的样本稀释液1‑7、一份正常人血清样本，在催乳素板上所测得的非特异性吸附NSB的信号结果；进一步地，发现在稀释液中加入牛血清γ球蛋白的样本稀释液3‑7，在两种包被不同抗体的ELISA板，即神经营养因子板和催乳素板中的非特异性吸附NSB都很小，从而说明所产生的背景值都非常低，为0.02‑0.045之间；进一步地，由于样本稀释液3‑7中的牛血清γ球蛋白浓度不同，但是都降低了ELISA反应中的背景信号；进一步地，说明牛血清γ球蛋白抗原对降低背景噪音具有直接且积极的作用。