[发明专利]基于荧光定量PCR的贝类多种病原生物检测试剂盒及方法

摘要

一种基于荧光定量PCR的贝类多种病原生物检测试剂盒及方法。该试剂盒包括8种试剂：裂解液、PCR反应液、dNTP混合物、Taq酶液、2×SYBR Premix Ex Taq反应预混液、引物对、阳性对照及阴性对照等。本发明提供了沙门氏菌、副溶血弧菌、派琴虫、折光马尔太虫和急性病毒性坏死病毒(AVNV)等5种病原生物的特异引物。本发明充分利用了荧光定量PCR技术的高效扩增性、核酸杂交的良好特异性和荧光检测技术的快速敏感性，反应结束便可根据扩增曲线即时判定待检测组织样本中是否含有上述该五种病原中的一种或几种及其含量，由于提供了退火温度相近的特异引物，因此能够同时对上述5种病原生物进行检测。本发明能够快速、特异的完成检测，方法简便，具有很高的推广价值。

主权项

一种基于PCR的贝类多种病原生物检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括： (1)裂解液：含有胰蛋白酶、Tris、EDTA，pH为7.5‑8.5，其浓度分别为1‑10mg/mL，10‑50mmol/L，1‑10mmol/L； (2)PCR反应液：含dNTP和MgCl2； dATP,dTTP,dCTP,和dGTP的四种混合物dNTP,其中每种溶液的浓度2.5mmol/L；MgCl2浓度为20‑30mmol/L； (3)Taq酶液：5U/μL； (4)2×SYBR Premix Ex Taq反应预混液； (5)引物对： 沙门氏菌：普通PCR引物——上游引物：5’‑CCGTATGGCTGGGCGTTT‑3’                             下游引物：5’‑AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG‑3’       荧光定量PCR引物——上游引物：5’‑CCGTATGGCTGGGCGTTT‑3’                             下游引物：5’‑AGTACGGCTAAAGCTTTCCGATAAG‑3’ 副溶血弧菌：普通PCR引物——上游引物：5’‑CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT‑3’                               下游引物：5’‑TCCGCTTCGCGCTCATCAATA‑3’            荧光定量PCR引物——上游引物：5’‑CGGCGTGGGTGTTTCGGTAGT‑3’                                  下游引物：5’‑TCCGCTTCGCGCTCATCAATA‑3’ 派琴虫：普通PCR引物——上游引物：5’‑CCGCTTTGTTTGGATCCC‑3’                           下游引物：5’‑ACATCAGGCCTTCTAATGATG‑3’          荧光定量PCR引物——上游引物：5’‑TACCTAGCGGGTTTTGCTACTC‑3’                                下游引物：5’‑GTCTACGACGACACGATAATGC‑3’ 折光马尔太虫：普通PCR引物——上游引物：5’‑CCGCACACGTTCTTCACTCC‑3’                                 下游引物：5’‑CTCGCGAGTTTCGACAGACG‑3’              荧光定量PCR引物——上游引物：5’‑GCTCTTCTTCCCGATACAAACA‑3’                                    下游引物：5’‑TAATACGCCTGCCTTCACAAG‑3’ AVNV：普通PCR引物——上游引物：5’‑TCTTTACCATGAAGATACCCACC‑3’                         下游引物：5’‑GTGCACGGCTTACCATTTTT‑3’ 荧光定量PCR引物——上游引物：5’‑AGCCTTTTACAGAATTTTGCACCTT‑3’                       下游引物：5’‑TGTCGCATGTTAACCTCGTCTG‑3’ (6)灭菌去离子水。 (7)阳性对照：含有上述5种病原DNA模板的混合液； (8)阴性对照：ddH2O 。