[发明专利]一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法

摘要

本发明公开了一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，本方法从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，以果荚里乳白色粉末状的幼胚为外植体。采用优化的新型培养基，与经典的MS培养基相比，无机盐等化学物、糖的用量少，针对培养的不同阶段在培养基中分别添加山芋泥、麸皮糊、香蕉皮匀浆液等食用或废弃物，碳源采用市售食用白糖，不添加激素。培养6个月种苗健壮，每棵苗高3-4厘米、具有3-4个节、6-8片叶、4-5条根、根长2-4厘米，移栽成活率达95%以上。之后转入原产地自然环境中栽培，可以保持野生石斛品质。幼胚繁殖率高，种苗繁殖周期缩短，培养基成本低，提高了山芋、麸皮、香蕉皮（废弃物）的利用价值，优化的培养基适用于大规模工厂化生产。

主权项

一种霍山石斛种苗无激素快速培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）原球茎培养    ①选择外植体     从霍山采摘生长100天左右尚未完全成熟的霍山石斛果荚，先用1%的洗洁精浸泡10‑15min，然后用流水刷洗干净；    ②灭菌     将洗净的果荚放入超净工作台无菌烧杯中，先用75%的酒精浸泡30‑60s，无菌水冲洗1次，再用5%的次氯酸钠溶液浸泡20‑30min，无菌水冲洗2‑3次；③接种培养 严格无菌操作，解剖刀沿果荚纵向切开，乳白色粉末状的幼胚直接接种在1号培养基:营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，幼胚在培养基的表面分散均匀，密而不成团，一个果荚可以接种4瓶；培养条件：室内温度24‑28℃，第一周暗培养，以后每天自然光照，培养10天，幼胚变成乳黄色开始胀大，培养20天发育成黄绿色的颗粒状，培养30天顶端长出很小的绿色的叶原基，培养45天发育成基部有丝状物翠绿的原球茎；（2）分化叶培养  在超净工作台的无菌区，接种铲从母瓶取出原球茎（不要铲到培养基）接入2号培养基：营养元素母液100ml/L+山芋泥100g/L+麸皮糊10g/L +白糖20g/L +琼脂8g/L中培养分化芽，1个母瓶可以接种5‑6瓶，每瓶接种1铲，原球茎在培养基的表面分散均匀，彼此间距2mm；培养条件：室内温度24‑28℃，自然光照，培养15天长出第一片叶，培养30天长出第二片叶，培养45天长成高1.0‑1.5cm健壮翠绿的小苗；（3）继代培养  用无菌圆头镊子轻轻取出小苗接入3号培养基:营养元素母液100ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液100g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，1个母瓶可以接种9‑10瓶，小芽在培养基的表面分散均匀，彼此间距5mm，培养条件同上，培养45天左右，长成苗高2‑2.5cm、3‑4片叶、2个节的大苗；   （4）分化根培养 从母瓶里取出大苗先放在培养皿中，轻轻剔除基部附着的培养基并分散开，接入4号培养基:营养元素母液50ml/L+山芋泥50g/L+麸皮糊10g/L+香蕉皮匀浆液80g/L+白糖10g/L+琼脂8g/L，进行生根培养，250 ml三角瓶接种20‑22棵，650 ml组培瓶接种25‑26棵，每棵间距1 cm，轻按苗基部接触培养基即可；每个母瓶可以接种12‑15瓶；培养条件同上，培养12天就有根萌发，培养50天左右，生长成健壮的完整植株，生根率为100%，每棵苗高3‑3.5cm，6‑8片叶， 3‑5条根，根长2‑3cm，根粗壮；（5）炼苗与移栽①炼苗选取苗高3‑4cm，具有6‑8片叶、3‑5条根的健壮试管苗，打开封口膜，在温度20‑30℃室内自然光下炼苗5‑7天；②移栽取出试管苗，洗净根部附着的培养基，将根部浸入0.5%KMnO4溶液中浸泡4‑6min，取出等根表面水分晾干；栽培基质为：水苔、小石子、栗粉，栽培容器小塑料杯，水苔用1%KMnO4溶液浸泡20‑30min后用洗衣机甩干，石子提前用水浸泡3‑5h；1‑2棵石斛为一簇将根捋顺，用一小缕水苔将其根部包裹，水苔以此为中心缠绕，每缠绕1.5cm包裹进1‑2棵石斛，茎基部不能包裹，松紧适中，包裹的大小与小塑料杯直径相当，放进塑料杯前杯底部先放少许的栗粉，上面用已浸泡好的小石子固定，放入室内，保持环境温度为20‑30℃，自然光照射，第一周不能浇水，每天用喷雾器喷雾2‑3次，前两周保持湿度为60‑70%，以后逐渐降低湿度、每周浇水一次、一次性浇透，一个月后统计苗的成活率。