[发明专利]一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及制备的药物

摘要

本发明公开了一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法及用其制备的治疗脑血管疾病、戒烟和减肥药物，主要步骤为：重组人CB1真核表达载体的构建；CB1高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备；亲和色谱分离、制备EGCG。本发明制备的中草药单体分子大麻受体CB1拮抗剂EGCG，作用温和，不良反应极其微小，具有良好发展前景和使用价值。

主权项

一种CB1拮抗剂EGCG的制备方法，其特征在于，该拮抗剂EGCG制备方法包括步骤：步骤一，重组人CB1真核表达载体的构建；组织总RNA的提取：取脑组织称重108mg，加入1.0ml Trizol，放入匀浆器中于冰上研磨，转入1.5mlEP管，混匀，静置5min后加入200μl氯仿，低温离心机，4℃，12000rpm，离心15min，取上层水相移入EP管，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10min，低温离心，加入1ml预冷的0.1％DEPC水配制的75％乙醇洗涤沉淀，超净台风干30min，加入400μl DEPC处理水溶解沉淀，琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察，判断RNA的完整性，紫外分光光度计测定OD值并计算RNA浓度，‑80℃保存备用；引物设计与合成：根据Genbank公布人CB1基因序列设计引物，在上游引物的5′加入HindIII酶切点，下游引物5′加入EcoR I酶切点，由上海英骏生物技术有限公司合成；pcDNA3.1‑hCB1的构建：逆转录试剂盒逆转录得到总cDNA，进行PCR克隆CB1基因，反应条件：94℃预变性4min；94℃变性30s；56℃退火30s；74℃延伸45s；最后74℃延伸7min，预期片段长度1400bp，产物用1％琼脂糖凝胶电泳，切胶并用DNA凝胶回收试剂盒纯化回收，回收的目的片段用HindIII和EcoR I双酶切2h，回收纯化，同时以HindIII和EcoR I酶酶切pcDNA3.1，回收纯化线性化质粒载体，将所获酶切片段以3∶1比例用T4DNA Ligase在20℃连接24h，将连接产物转化到感受态DH5α中，涂布含氨苄青霉素的LB固体培养基，挑取单个阳性克隆并扩增重组质粒，质粒试剂盒提取pcDNA3.1‑hCB1，双酶切PCR鉴定，进行测序鉴定；CB1真核表达载体转染：将重组载体pcDNA3.1‑hCB1瞬时转染入HEK293细胞，转染采用Lipofectamine2000试剂进行，转染后48h收集细胞，制备细胞裂解液和总RNA进行下一步分析；步骤二，CB1高表达HEK293细胞膜及细胞膜色谱柱的制备：取在37℃，5％ CO₂及饱和湿度条件下，培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，常规传代，细胞贴壁生长单层覆盖培养皿底部90％，0.25胰蛋白酶液消化，收集细胞，血球计数板计数，取8×10⁶细胞，4℃，1000g离心8min，加入10mL预冷磷酸缓冲液吹打混悬，条件同上离心10min，重复上述操作一次，倾出上清液加入8mL低渗缓冲液，冰块中匀浆，低温超声破膜30min，4℃条件下再次12000g离心20min，倾去上层液，加入5mLTris‑HCl缓冲液重悬，备用，分光光度计680nm处测定组织样品和牛血清蛋白标准液，测定光密度值，考马斯亮蓝染色法测定膜蛋白含量，取色谱柱柱芯，制得CB1细胞色谱柱；步骤三，亲和色谱分离、制备EGCG将自制细胞膜色谱柱接到高效液相色谱仪，茶叶提取物用微孔滤膜0.45μm滤过，进样20μL，色谱条件为：柱温37℃；流速0.5mL·min^‑1，pH7.4，流动相磷酸盐缓冲液50mmol·min^‑1，紫外检测波长280nm用流动相平衡2h后进样20μL分离，收集3.5‑4.0min洗脱液，即获得CB1选择性拮抗剂EGCG。