[发明专利]一种油藏微生物基因组DNA提取方法

摘要

本发明涉及微生物采油技术领域，特别涉及一种油藏微生物基因组DNA提取方法，具体包括以下步骤：有机溶剂萃取去除样品中原油对提取的干扰，并释放油水界面的微生物，以中空纤维膜过滤过滤水相富集微生物，以物理破壁方法结合溶菌酶、蜗牛酶、蛋白酶、十二烷基硫酸钠等裂解细胞，在高盐条件下通过苯酚、氯仿去除蛋白质等有机大分子组份，随后通过核酸抽提及沉淀，获得油藏微生物基因组DNA。本发明所述方法快捷简单，整个提取过程可在10小时之内完成；提取效率高，所获基因组纯度高。

主权项

一种油藏微生物基因组DNA提取方法，其特征在于以下包括步骤：（1）有机溶剂萃取除去原油，释放油水界面微生物在液相样品中加入石油醚，其与液相样品的体积比为1：4～6，充分震荡混合均匀后静置1h～2h，使有机相和水相分层，取下层水相。（2）收集菌体将上述所得的水相，利用蠕动泵，控制压力为0.5MPa，在0.22μm的中空纤维素膜过滤器进行过滤，收集菌体。（3）裂解微生物细胞首先，将上述过滤器的中空纤维素膜，剪碎与石英砂相混合，放入含有800μl～1000μl提取缓冲液的离心管中，加入450μl1xTE和50μl10mg/mL溶菌酶和10μl100mg/mL蜗牛酶，吹吸混匀，37℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，其次，加入600μl裂解液，吹吸混匀，涡旋震荡10min后，再加入30μl20mg/mL蛋白酶K，吹吸混匀，55℃孵育1h，每隔15min颠倒混匀一次，最后，4℃12000rpm离心10min，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管。（4）DNA提纯首先，按照体积比为25:24:1的比例加入酚、氯仿和异戊醇，充分混匀，‑20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，其次，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，按照体积比为24:1的比例加入氯仿和异戊醇，充分混匀，‑20℃静置2min，4℃12000rpm离心5min，接着，转移上清至另一个干净的1.5mL离心管，加入1/10体积的3M醋酸钠，加入醋酸钠后的终体积2倍体积预冷的无水乙醇，充分混匀，‑20℃沉淀2h，4℃12000rpm离心10min，弃上清，在次，加入600μl预冷的70%乙醇洗涤DNA沉淀，颠倒混匀，4℃12000rpm离心5min，弃上清，最后，重复洗涤一次，吸干离心管中的残留液体，待离心管风干后，加入30μl无菌水和0.5μl10mg/mL的RNase A，吹吸混匀，取3μl电泳检测，剩余置于‑20℃保存。