[发明专利]一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法

摘要

本发明公开了一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因功能的方法，利用病毒诱导基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法对辣椒果实果色发育相关基因和辣椒果色发育无关基因进行功能鉴定，主要包括：构建基因沉默表达载体，经农杆菌GV3101介导侵染辣椒离体果实并观察果色表型的变化。产生沉默效果的离体辣椒果实表现出明显地橙色或黄色症状，说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关；相反，果实的果皮颜色转色正常，或果皮颜色没有出现明显变化的，则说明被鉴定基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。该方法为快速验证大量与辣椒果实果色发育相关基因功能提供了方便，可极大地加快辣椒果实品质分子育种进程。

主权项

一种快速鉴定辣椒果实果色发育相关基因的方法，其特征在于，该方法利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体果实果色变化相结合的方法，对辣椒果实果色发育相关基因的功能分析，具体步骤如下：1）辣椒材料的准备：选择籽粒饱满的成熟辣椒种子，55℃温汤浸种20min，清水浸泡5h，28℃，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，当植株长出8～10片真叶时，移栽塑料大棚进行自然生长，待辣椒花后35天果实处于绿熟期时，采摘果龄一致的果实，带回实验室用于病毒诱导的基因沉默注射；2）病毒注射后辣椒离体果实的培养：将注射后的辣椒果实放入人工气候箱，18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx条件下进行培养15d，观察辣椒离体果实果色表型变化；3）重组病毒载体的构建：（1）辣椒果实总RNA的提取与cDNA第一链合成：采用Trizol法提取辣椒果实总RNA，按TaKaRa公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成；（2）目的基因片段的克隆：用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150‑500bp之间；根据GenBank公布的或已克隆的与辣椒果实果色发育相关基因，以及与辣椒果实果色发育无关基因序列，设计合适的引物序列；以步骤（1）合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒回收目的基因；利用T4DNA连接酶将回收产物连接到克隆载体pMD19‑T上，16℃过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR 检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即用于构建基因沉默表达载体；（3）重组载体构建：选择病毒载体为烟草脆裂病毒载体pTRV1和pTRV2；选择合适的酶切位点对病毒载体pTRV2和步骤（2）经过测序验证含有目的基因序列的克隆载体进行双酶切，37℃过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒回收，利用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16℃过夜，转化感受态DH5a，用菌落PCR和酶切方法检测出目的基因片段，证明目的基因已经成功转入病毒载体中；（4）转化农杆菌：利用冻融法将pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤（3）构建好的重组病毒载体分别导入农杆菌菌株GV3101中，经PCR检测确定为目的基因，保存菌液以备用；4）农杆菌菌液注射：（1）农杆菌菌液准备：将携带pTRV1载体、pTRV2空载体和步骤3）构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化；（2）注射接种：在注射前将所需镊子、不锈钢果盘、果盘内底部所衬滤纸进行高压灭菌，烘干后转入超净工作台，紫外灯照射30min备用；果实注射前处理：将离体辣椒果实果面用自来水冲洗干净，再用蒸馏水冲洗2‑3次，室内晾干。然后将清洗过的辣椒果实的果柄在事先熔好的石蜡中快速蘸一下封住果柄顶端伤口，转入超净工作台中。消毒及注射：将待注射的果实在75%酒精中快速浸蘸30秒后取出，再用无菌水清洗2‑3次，然后在靠近辣椒果实的果柄基部先用注射器针头扎个 小洞，针头刺入深度约为果柄直径的1/2处，然后用去掉针头的注射器在果柄针孔处注射菌液0.5ml，可见整个果柄出现水渍状；将注射接种后的离体辣椒果实放入衬有灭菌滤纸的不锈钢果盘中，果实摆放整齐，用保鲜膜封好果盘后置于人工气候箱中；18℃、暗培养2d后，转为25℃/20℃、16h/8h、相对湿度35%，光照20000lx，条件下进行培养，观察并记录辣椒离体果实果色的表型变化；5）基因沉默效果检测：（1）沉默表型观察：辣椒果实农杆菌注射接种8d～15d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内；（2）鉴定辣椒果实待检测基因功能：鉴定方法：与正常对照相比，注射携带目的基因病毒载体的果实果色呈现橙色或黄色，说明被检测基因与辣椒果实果色发育相关；相反，果实颜色正常转红或与对照相比果皮红色没有明显差异的，则说明被检测基因与辣椒果实果色发育无关，或是无功能基因。