[发明专利]一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法

摘要

本发明公开了一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，包括以下步骤：基因组水平克隆：提取梅花叶片中的DNA；引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；PCR产物的回收和纯化；克隆；基因编码区全序列克隆：提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；引物的设计及PCR反应：在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；PCR产物的回收和纯化；克隆。本发明具有节约成本、简便易行的特点，适合推广应用。

主权项

一种克隆梅花中LFY同源基因编码区全序列的方法，其特征在于，包括以下步骤：A、基因组水平克隆A1、提取梅花叶片中的DNA；A2、引物的设计及PCR反应：设计一对简并引物，上游引物在起始密码子的上游区域设计，下游引物在终止密码子的下游区域设计；设计的引物为：上游引物P1：5′‑GGAAAATATGGATCCRGA‑3′下游引物P2：5′‑TCARTAGGGYAGGTGMTC‑3′用DNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系：2μL10×EX Taq buffer，1.6μL dNTP(10mmol·L‑1)，0.2μL的Ex Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH2O，反应条件为95℃预变性5min，30个循环：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃，10min；A3、PCR产物的回收和纯化；A4、克隆；B、基因编码区全序列克隆B1、提取梅花叶片中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；B2、引物的设计及PCR反应：在基因组测序结果的基础上设计一对特异性引物，上下游引物分别包括起始密码子和终止密码子；设计的引物为：上游引物Q1：5′‑ATGGATCCAGACGCCTTCTC‑3′下游引物Q2：5′‑TCAGTAGGGTAGGTGATCACTGC‑3′用cDNA为模板进行PCR操作扩增LFY同源基因，PCR反应体系为20ul体系：2μL10×EX Taq buffer，1.6μL dNTP：10mmol·L‑1，0.2μL的Ex Tap酶，上下游引物各0.4μL，1μL的DNA，14.4μL的ddH2O.)，反应条件为95℃预变性5min，30个循环：94℃，50s；58℃，50s；72℃，1min30s，最后72℃10min；B3、PCR产物的回收和纯化；B4、克隆。