[发明专利]一种百菌清人工抗原的合成方法

摘要

一种百菌清人工抗原的合成方法，属于生物化工技术领域。本发明以百菌清原药与6-氨基己酸反应得到具有羧基产物为半抗原CTNH，再用碳二亚胺法将CTNH与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联得偶联物CTNH-BSA用作免疫抗原，将CTNH与载体蛋白鸡卵清白蛋白OVA偶联得偶联物CTNH-OVA用作包被抗原，用紫外法测定偶联物的偶联比。本发明成功合成了百菌清人工抗原，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原。

主权项

一种百菌清人工抗原的合成方法，其特征在于：百菌清原药与6‑氨基己酸反应得到具有羧基的半抗原CTNH，再用碳二亚胺法将CTNH与载体蛋白牛血清白蛋白BSA偶联得偶联物CTNH‑BSA用作免疫抗原，将CTNH与载体蛋白鸡卵清白蛋白OVA偶联得偶联物CTNH‑OVA用作包被抗原，用紫外法测定偶联物的偶联比；步骤为：（1）半抗原的合成：称取百菌清原药1.9mmol，KOH 1.9mmol，6‑氨基己酸2mmol，将这三种药物溶于20mL乙醇，60℃反应12h，再在90℃反应12h，将反应物旋转蒸发，再用20mL水溶解，用盐酸调pH至4‑5，产生沉淀，将沉淀烘干即为半抗原CTNH，用液质连用技术进行鉴定与分析；（2）免疫抗原CTNH‑BSA的制备制备A液：称取35.8mg CTNH，1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺EDC 56.9mg，N‑羟基丁二酰亚胺NHS 35.6mg，用1mL无水二甲基甲酰胺DMF溶解，室温搅拌反应8h，得A液；制备B液：称取牛血清白蛋白BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS中，得B液；在室温条件下，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CTNH‑BSA混合液；透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CTNH‑BSA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液；CTNH‑BSA用作免疫抗原；（3）包被抗原CTNH‑OVA的制备制备C液：称取40mg CTNH，溶于1mL无水DMF，依次滴加32μL三正丁胺和17.5μL的氯甲酸异丁酯，4℃搅拌反应1h，得C液；制备D液：称取鸡卵清白蛋白OVA 166mg溶于30mL的PBS中，得D液；在4℃下，逐滴将C液加入到D液中，4℃反应5h，即得偶联物CTNH‑OVA混合液；透析袋前处理：取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60℃的去离子水冲洗3min，保存在4℃去离子水中备用；将偶联物CTNH‑OVA混合液放入透析袋于0.01mol/L的PBS中透析3天，每天三次换液，CTNH‑OVA用作包被抗原；（4）百菌清人工抗原的鉴定①采用液质连用技术鉴定半抗原；②人工抗原采用紫外法鉴定其偶联结果，根据偶联物中小分子与蛋白的浓度，计算其偶联比。