[发明专利]人参培养细胞染色体分离方法有效
申请号: | 201310644130.4 | 申请日: | 2013-12-05 |
公开(公告)号: | CN103602628A | 公开(公告)日: | 2014-02-26 |
发明(设计)人: | 戴凌燕;岳才军;王祥;黄玉兰 | 申请(专利权)人: | 黑龙江八一农垦大学 |
主分类号: | C12N5/04 | 分类号: | C12N5/04 |
代理公司: | 哈尔滨东方专利事务所 23118 | 代理人: | 曹爱华 |
地址: | 163319 黑龙江省*** | 国省代码: | 黑龙江;23 |
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摘要: | 本发明涉及的是人参培养细胞染色体分离方法,这种人参培养细胞染色体分离方法如下,一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜,将相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%秋水仙素处理16h,用MS培养基洗涤后称10克,放入100ml裂解液中,解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞质膜12h;二、人参悬浮细胞细胞核纯化,过滤,自然沉降得到上清液,吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心,2000×g离心浓缩细胞核,低温保存;三、人参悬浮细胞染色体纯化,收集细胞核破除核膜,低渗与溶膜,蔗糖密度梯度离心收集染色体,500×g离心下60min,大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上,收集这个界面4000×g离心浓缩染色体,低温保存。本发明分离纯化染色体的速度较快。 | ||
搜索关键词: | 人参 培养 细胞 染色体 分离 方法 | ||
【主权项】:
一种人参培养细胞染色体分离方法,其特征在于:这种人参培养细胞染色体分离方法如下,一、人参悬浮细胞预处理和酶解去除细胞壁细胞膜: 选择生长周期里11‑13天内颜色呈淡黄色的人参悬浮细胞,把细胞抽滤后,放在MS培养基里悬浮,自然沉降1‑2分钟,除去细胞中的小的空核及白色絮状物质,挑出相对饱满的细胞用质量百分比为0.1%秋水仙素处理16h,用MS培养基洗涤后称10克,放入100ml裂解液中,35℃下50rpm的摇床上解离人参悬浮细胞的细胞壁和细胞质膜12h; 二、人参悬浮细胞细胞核纯化: 过滤:将步骤一得到的酶解液在10×g ‑20×g 离心3min,吸取上清液在300目附加两层薄棉纸的滤网上抽滤; 自然沉降:收集滤液在4℃冰箱中自然沉降5h,去中层滤液,得到上清液;蔗糖密度梯度离心:吸取上清液进行蔗糖密度梯度离心,蔗糖梯度设置为:最底层是质量百分比为40%的蔗糖溶液1ml,向上依次铺上质量百分比为35%、30%和25%的蔗糖溶液各1ml,将上清液置于最上面,500×g离心下30min‑60min,大量细胞核都集中在质量百分比为30%蔗糖界面上,收集这个界面2000×g离心浓缩细胞核,低温保存;三、人参悬浮细胞染色体纯化:低渗与溶膜:收集细胞核用0.75M 1,6己二醇破除核膜,将收集到的细胞核用75mmol/L氯化钾4℃低渗10min,1000rpm离心10min,沉淀悬于0.75mol/L 1,6‑己二醇的GCW缓冲溶液中,GCW缓冲溶液pH为4.0,37℃水浴10min,接着冰上30min,再用7号针头10ml注射器推挤;蔗糖密度梯度离心收集染色体:将染色体溶液进行蔗糖密度梯度离心,蔗糖梯度设置为:最底层是质量百分比为35%的蔗糖溶液1ml,向上依次铺上质量百分比为30%的蔗糖溶液1ml、质量百分比为25%的蔗糖溶液0.5ml,将染色体溶液置于最上面,500×g离心下60min,大量染色体都集中在质量百分比为25%蔗糖界面上,收集这个界面4000×g离心浓缩染色体,低温保存。
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