[发明专利]小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法

摘要

本发明公开了一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，通过小麦成熟胚培养的前处理、有机物的添加及培养、转化技术过程的优化，获得了与小麦幼胚愈伤组织诱导、再生和转化效率相近的技术效果，与已报道的成熟胚愈伤组织基因抢转化技术相比，该成熟胚愈伤组织遗传转化方法转化效率高，其诱导、分化及转化能力接近于幼胚愈伤组织，克服了以往小麦成熟胚愈伤组织基因抢转化中愈伤组织诱导率、再生频率和转化效率低的技术弊端，使小麦遗传转化不受受体组织取材季节、时段的限制，利用当年收获或储藏1年种子成熟胚随时进行高效转化研究成为可能，提高了小麦遗传转化和分子育种效率。

主权项

一种小麦成熟胚愈伤组织基因枪遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：1）成熟胚的选择与预处理：选取当年收获或储藏1年左右、籽粒饱满的小麦种子，用无菌水冲洗2次，在无菌条件下，用质量分数为70%的酒精消毒5min，然后在浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡种子15min，无菌水冲洗4次；消毒后的小麦种子置10mg/L的噻二唑苯基脲（TDZ）溶液中于25℃室温条件下预处理15h；2）接种与愈伤组织的诱导：预处理后的小麦种子用浓度为0.1%的升汞溶液再次消毒10min，无菌水洗4次，于无菌条件下剥取成熟胚，接种于成熟胚愈伤组织诱导培养基上诱导愈伤组织；所述的小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基以通用MS培养基为基准，添加以下物质：2，4‑二氯苯氧乙酸（2，4‑D）：2.0mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L‑天门冬酰胺：250mg/L，L‑谷氨酰胺：200mg/L；蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；通用培养基MS的配方为：硝酸钾（KNO3）：1900mg/L，硝酸氨（NH4NO3）：1650mg/L，氯化钙（CaCl2·2H2O）：440mg/L，硫酸镁（MgSO4·7H2O）：370mg/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）：170mg/L，硫酸亚铁（FeSO4·7H2O）：27.8mg/L，乙二酸四乙钠（Na2EDTA）：37.3mg/L，硫酸锰（MnSO4·4H2O）：22.3mg/L，硫酸锌（ZnSO4·7H2O）：8.6mg/L，硼酸（H3BO3）：6.2mg/L，碘化钾（KI）：0.83mg/L，钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）：0.25mg/L，硫酸铜（CuSO4·5H2O）：0.025mg/L，氯化钴（CoCl2·6H2O）：0.025mg/L，肌醇100mg/L，盐酸硫胺素：0.5mg/L，盐酸吡哆锌：0.5mg/L，烟酸：0.5mg/L，甘氨酸：2mg/L；调整成熟胚愈伤组织诱导培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；3）高渗培养：小麦成熟胚组织诱导培养5天后陆续产生成熟胚愈伤组织，挑选诱导12天、质地致密的成熟胚愈伤组织转移到高渗培养基中，于20℃黑暗条件高渗培养6h；所述的高渗培养基为上述小麦成熟胚愈伤组织诱导培养基中再附加0.2mol/L的甘露醇和0.2mol/L的山梨醇；4）基因枪轰击转化：经高渗处理后的成熟胚愈伤组织用常规的基因枪转化方法进行轰击转化，基因枪轰击参数为：金粉直径1.0μm，阻挡网与轰击材料之间的距离为9.0cm，可裂膜压力为1100Pa，每枪金粉/DNA用量为1μg/60μg，每皿材料轰击2次；5）恢复培养：基因枪轰击后的成熟胚愈伤组织在上述高渗培养基上继续暗培养18h后，将愈伤组织从高渗培养基转移至恢复培养基中，于26℃暗培养13天；所述的小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基以通用MS培养基为基准，添加以下物质：2，4‑二氯苯氧乙酸（2，4‑D）：1.5mg/L，6‑呋喃基氨基嘌呤（KT）：0.5mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L‑天门冬酰胺：250mg/L，L‑谷氨酰胺：200mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；调整小麦成熟胚愈伤组织恢复培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；6）抗性筛选：恢复培养后的愈伤组织转移到抗性筛选培养基上，于26℃、3000lx光 照下进行抗性细胞筛选，所述抗性筛选培养基以通用MS培养基为基准，添加以下物质：2，4‑二氯苯氧乙酸（2，4‑D）：1.0mg/L，6‑呋喃基氨基嘌呤（KT）：0.5mg/L，α‑萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，水解酪蛋白：500mg/L，L‑天门冬酰胺：250mg/L，L‑谷氨酰胺：200mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，卡拉霉素：100mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；调整抗性筛选培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；7）分化培养：恢复及筛选培养后的成熟胚愈伤组织转至分化培养基上进行分化培养；培养温度为25～28℃，光照度3000lx，每天光照12h；筛选再生的成熟胚愈伤组织，并在分化培养基上分化出芽苗；所述的分化培养基以通用培养基MS为基准，添加以下物质：6－呋喃基氨基嘌呤（KT）：2.0mg/L，α‑萘乙酸（NAA）：0.01mg/L，酪蛋白：500mg/L，生物素：0.5mg/L，盐酸硫胺素（VB1）：8.0mg/L，蔗糖：15000mg/L，麦芽糖：15000mg/L，琼脂：5000mg/L；调整分化培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅(压力：1.0kg／cm2)灭菌20分钟；8）壮苗、生根培养：待成熟胚愈伤组织分化的芽苗长至2～3片叶时转移到生根、壮苗培养基上，于25℃、3000Lx光照条件下进行壮苗、生根培养；所述的生根、壮苗培养基以通用培养基MS为基准，且将MS通用培养的无机盐浓度降低一半，其中添加α－奈乙酸（NAA）0.5mg/L，蔗糖：30000mg/L，琼脂：5000mg/L；调整壮苗、生根培养基的pH值为5.6，置于高压灭菌锅灭菌20分钟；9）移植：在生根、培壮苗养基上，生长健壮的成熟胚愈伤组织再生植株及时移栽 到营养钵中，于15℃、3000Lx光照条件下缓苗，待完全缓苗且进一步生长10天后，在3‑4℃低温春化条件下处理20天，即得到转化的转基因株；10）分子检测并筛选：用常规的分子检测技术对转化的转基因的抗性个体进行分子检测。