[发明专利]一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法

摘要

本发明涉及一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，属于生物制剂技术领域。该方法具体包括以下步骤：(1)制备免疫原准备：采用猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白；(2)采用免疫程序；(3)抗体效价测定；(4)纯化卵黄抗体；(5)鉴定卵黄抗体。本发明采取水稀释法，该法安全可靠没有污染，成本低，经过以上处理的高免蛋可以获得活性高、纯度高，产量高，性质稳定的卵黄抗体，操作方法简单易行可靠，有利于工业化生产。

主权项

一种治疗猪病毒性腹泻生物制剂的制备和应用方法，其特征在于：具体包括以下步骤：(1)制备免疫原准备：采用猪传染性胃肠炎猪流行性腹泻二联灭活疫苗，该疫苗含有两种病毒蛋白；(2)免疫程序：初次免疫剂量1m L，胸部皮下多点注射；分别间隔两周进行第2次免疫、第3次免疫和第4次免疫，免疫剂量分别为1ml、1.5ml、1ml，4免后28天加强免疫，注射剂量为1ml；(3)测定抗体效价：第1次免疫1周后每周收集高免蛋和采集血清，并利用猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒抗体检测试剂盒检测高免卵黄抗体和血清效价，待血清抗体效价达到2000，卵黄抗体浓度达到4.5mg／ml时收集高免蛋；(4)纯化卵黄抗体：将鸡蛋浸入0.1％新洁尔灭水溶液中消毒15min，自然晾干，无菌条件下分离并收集卵黄；向其中加9倍体积4℃双蒸水，缓慢加入1％辛酸，充分搅拌均匀，盐酸调整pH值至5.3，4℃静置10h后低温12000r／min离心25min，收集上清液，即为水溶性组分(WSF)；WSF进行0.22μm滤膜微滤，除去细菌和杂质颗粒，然后进行超滤；超滤时调节WSF的温度为25℃，pH6.5，操作压力为0.05MPa，截留分子量为50KD膜包，浓缩倍数根据需要进行选择；对获得的浓缩液用氨水调pH至7.0，缓慢加入等体积饱和硫酸铵溶液使其浓度达到50％；4℃静置2h离心25min，取沉淀；再加入适量pH为7.4PBS溶解，加入饱和硫酸铵使其最终浓度为33％，静置2h，同上步离心，取沉淀并用适量PBS溶解，即为提取的卵黄抗体；(5)鉴定卵黄抗体：卵黄抗体的浓度采用紫外可见分光光度计和考马斯亮蓝法进行测定；卵黄抗体的纯度采用十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS‑PEGE)进行确定；卵黄抗体效价和特异性用猪病毒性腹泻抗体检测试剂盒和western bolting进行确定；卵黄抗体的无菌检测采用细菌培养法；并对卵黄抗体进行安全性检查、人工感染治疗效果鉴定。