[发明专利]通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法

摘要

本发明提供一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法。所述培养雄性不育烟草单倍体的方法是以未授粉的雄性不育烟草花蕾发育介于大孢子母细胞时期到二核期之间的胚珠为培养材料，经过消毒处理后在28℃光照培养室中，依次经过胚状体诱导培养、再生芽生根培养和再生植株的培养之后培养而成，在培养过程过每天在1500Lux光照条件下连续光照十个小时。采用本发明的方法培育雄性不育烟草，明显提高了烟草胚珠胚状体的诱导和植株再生的频率。

主权项

一种通过未受精胚珠培养雄性不育烟草单倍体的方法，其特征在于具体步骤如下：（1）制备培养基采用H1培养基或H2培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、细胞分裂素KT、蔗糖和琼脂制备成胚状体诱导培养基，其中生长素IAA和细胞分裂素KT在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是0.5mg/L和2mg/L；所述蔗糖和琼脂在胚状体诱导培养基中的终浓度分别是2%和1%；采用H1培养基作为基本培养基，然后加入蔗糖和琼脂制备成不含激素的固体状再生芽诱导培养基，其中，所述蔗糖和琼脂在再生芽诱导培养基中的终浓度是2%和1%；采用H1培养基和N6培养基作为基本培养基，然后加入生长素IAA、蔗糖和琼脂制备成固体状再生芽生根培养基，其中生长素IAA在再生芽生根培养基中的终浓度是10mg/L，蔗糖和琼脂在再生芽生根培养基中的终浓度分别是8%和0.8%；（2）培养材料的采集，在雄性不育烟草开花期间，采胚珠发育介于大孢子母细胞时期到二核期之间的未授粉的雄性不育烟草花蕾；（3）消毒处理和接种，将步骤（2）中采集的雄性不育烟草花蕾放入浓度为0.1%的升汞水溶液中消毒7‑9min，然后用无菌水冲洗3‑4次，在无菌条件下将花蕾的基部切掉，挤出子房，并去除子房壁或直接剥离胚珠后，将胚珠放入步骤（1）中制备的胚状体诱导培养基中；（4）胚状体的诱导，将步骤（3）中接种有胚珠的胚状体诱导培养基置于28℃光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，诱导胚珠产生胚状体；（5）再生芽的诱导，将步骤（4）中获得的胚状体在无菌条件下转移到步骤（1）中制备的再生芽诱导培养基上，继续置于28℃光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，培养2‑3周，诱导胚状体产生再生芽；（6）再生植株的培养，将步骤（5）中获得的再生芽在无菌条件下转移到再生芽生根培养基上，继续置于28℃光照培养室中，每天在1500Lux光照下连续光照培养10小时，培养2‑3周，使其生根形成小植株，之后，对萌发根的再生植株转移到新配制的再生芽生根培养基上在同样的条件下继续培养，形成雄性不育烟草单倍体再生植株。