[发明专利]重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法

摘要

本发明公开一种重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb-1蛋白的制备方法，是对其成熟肽编码区进行密码子优化，采用重叠PCR单向延伸方法获得经优化的Defb-1蛋白成熟肽编码序列，连入pET-32a(+)载体，获得重组表达质粒，并转化至大肠杆菌TransB（DE3）感受态细胞中；通过IPTG诱导获得重组蛋白的可溶性表达；利用重组蛋白含有的His标签，对重组蛋白进行鉴定和纯化，可以快速高效获得重组红鳍东方鲀抗菌肽。不仅操作简单，降低制作成本，更主要的是蛋白结构不受破坏，重组蛋白纯度好、得率高且不易降解，适应于工业化生产，表达产物可用于制作饲料添加剂、产品保鲜剂和医药产品等。

主权项

一种重组红鳍东方鲀抗菌肽Defb‑1蛋白的制备方法，其特征按如下步骤进行：a. 以pET32a+载体为模板，用引物pETF19/pETR19进行PCR扩增；所述引物pETF19/pETR19序列如下：pETF19：5’‑GGGAAAGGCTTCCAGTGCTGCTACCGACGACGACGACAAG‑3’；pETR19：5’‑TCTCAGTGGTGGTGGTGGT‑3’；b. 以a步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物76F20/pETR19进行PCR；所述引物76F20序列如下：5’‑AAATGTTTTTTGGGCCTCTGGGCTGTGGGAAAGGCTTCCAGTGCTG‑3’；c. 以b步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物50F21/pETR19进行PCR扩增；所述引物50F21序列如下：5’‑TGTAGGAAGGTTTGCCTCCCAACTGAAATGTTTTTTGGGCCTCTGG‑3’；d. 以c步骤反应产物的20倍稀释液为模版，用引物25F21/pETR19进行PCR扩增，所述引物25F21序列如下：5’‑ACTTGTCCAAGCCTGAGCGGCGTGTGTAGGAAGGTTTGCCTCCCA‑3’；e. 以d步骤反应产物的20倍稀释液为模板，用引物NcoIF/XhoIR进行PCR扩增，所述引物NcoIF/XhoIR序列如下：上游引物NcoIF：5’‑CATGCCATGGGCACTTGTCCAAGCCTGAG‑3’；下游引物XhoIR：5’‑CCGCTCGAGTCAGCAGCACTGGAAGCCTT‑3’；f. 电泳回收e步骤PCR产物与克隆载体pMD19T连接，转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，再涂布于含氨苄青霉素、IPTG和X‑gal的LB固体平板上培养，通过蓝白斑筛选阳性克隆，选择120bp 大小的条带进行回收；g．用限制性内切酶NcoI和XhoI分别双酶切f步骤所回收产物的质粒和表达载体pET‑32a(+)，将得到的两种目的基因片断用T4 DNA连接酶连接，将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞DH5α进行培养并筛选提取重组表达质粒；h．将所提取的重组表达质粒转化入大肠杆菌表达菌株TransB(DE3)大肠杆菌感受态细胞内，挑取单克隆经IPTG诱导后收集菌体；i. 将收集的菌体用pH8.0、0.5M Tris‑HCl缓冲溶液重悬，进行超声波破碎，离心取上清，过Ni‑TNA柱纯化，收集洗脱液；j. 将洗脱液透析，获得重组表达蛋白。