[发明专利]一种快速检测转基因大豆MON89788的实时荧光PCR方法

摘要

本发明公开了一种快速检测转基因大豆MON89788的实时荧光PCR方法，包括：制样与DNA提取、实时荧光PCR和结果判定等步骤，本发明建立的转基因大豆MON89788实时荧光PCR方法，提高了检测的灵敏度与特异性，检测灵敏度达到0.1%，缩短了实验时间，简化了实验操作，能够很好地适用于进出口和国内的转基因大豆MON89788及其制品的监测需求。同时，本发明中使用的阳性对照品是根据大豆内标准基因lectin与转基因大豆MON89788品系特异性序列设计的质粒标准分子，相对于传统的植物原材料标准物质，具有纯度高、易获得、经济高效等优点。

主权项

一种快速检测转基因大豆MON89788的实时荧光PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：1）制样与DNA提取取大豆或其加工产品的样品，粉碎，用常规核酸提取方法提取DNA，确保DNA纯度应符合PCR检测要求；2）实时荧光PCR反应体系为25μL：2‑5μL的DNA模板，12.5μL LightCycler 480 Probes Master，0.75μL引物MON89788‑F、0.75μL引物MON89788‑R，0.5μL探针MON89788‑P，去离子水补齐体积；反应条件为：预变性95℃ 10min；变性95℃ 15s，退火延伸60℃ 1min，45个循环；同时设置阴阳性对照与空白对照，阳性对照为质粒标准分子pMD19T‑MON89788，阴性对照为非转基因大豆基因组DNA，空白对照为无菌水；其中，引物与探针序为：引物MON89788‑F：5’‑CGCTTCAATCGTGGTTATCA‑3’，引物MON89788‑R：5’‑CGAGCAGGACCTGCAGAAG‑3’；探针MON89788‑P：FAM‑CTGAAGGCGGGAAACGACAATCTGA‑BHQ1；质粒标准分子pMD19T‑MON89788为克隆有SEQ ID NO.3所示序列的质粒；3）结果判定质控标准：空白对照无荧光增幅现象；阴性目标DNA对照无荧光增幅现象；阳性目标DNA对照检测Ct值小于或等于34；如有一项不符合者，重复步骤1）和2）；结果判断：待测样品Ct值大于或等于40，设置的对照结果正常者，则判定该样品未检出转基因大豆MON89788；待测样品Ct值小于或等于36，设置的对照结果正常者，则判定该样品检出转基因大豆MON89788；待测样品Ct值在36～40之间，重复步骤2），再次扩增后的结果Ct值仍小于40，且设置的对照结果正常，则可判定该样品检出转基因大豆MON89788；再次扩增后结果Ct值大于40，且设置的对照结果正常，判定该样品未检出转基因大豆MON89788。