[发明专利]一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种检测17β-雌二醇的电化学免疫传感器。该免疫传感器利用电极表面修饰技术，将制备的氧化石墨烯-聚苯胺复合物(GO-PANI)修饰电极表面，然后通过电聚合的方法在电极表面聚合一层铂金合金（Au-PtNPs），再修饰17β-雌二醇完全抗原在电极表面，同时修饰抗体复合物（PDA-PtNPs-AuNPs-Ab-HRP）和17β-雌二醇标准品在电极表面，这样其完全抗原和标准品同时竞争结合抗体复合物上的抗体，结合在电极表面的抗体复合物上的HRP催化底物H2O2产生信号，这样通过添加底物H2O2前后的信号变化和标准品浓度之前的关系绘制工作曲线，达到检测17β-雌二醇的目的。本文发明的PDA-PtNPs-AuNPs纳米材料是第一次合成，且GO-PANI复合物导电性能强，Au-PtNPs纳米合金具有良好的生物相容性，对H2O2具有一定的催化性能。电化学免疫传感器具有灵敏度高，检测速度快的优点，检测周期短。便于实际样品的快速检测。

主权项

本文发明的技术方案，包括以下步骤：1、检测17β‑雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：(1)石墨烯‑聚苯胺的制备：25 mg的GO溶于50 ml 1 mol/L H2SO4中，超声1 h，形成分散均匀的溶液；加入200 μL的苯胺单体再超声30 min；加入0.06 g的(NH4)2S4O8，20 ℃超声2 h；得到的复合物通过过滤收集，60℃干燥；(2) 抗体和辣根过氧化物酶标记层的制备： 2 ml 1%的H2PtCl6·6H2O加入到8 ml 水中，80℃搅拌状态下加入1%的硼氢化钠溶液，搅拌4 h，得到PtNPs；5.0 mg的多巴胺加入到5.0 ml PtNPs溶液中，用Tris–HCl将pH 调节至8.5，室温下搅拌5 h；离心用水清洗三次，得到多巴胺功能化的PtNPs；在将其加入到含有20 mg柠檬酸钠的HAuCl4溶液中，室温下搅拌两个小时；离心清洗得到PDA‑PtNPs‑AuNPs纳米材料，溶于5 ml水中备用；100 μL，1mg/mL的辣根过氧化物酶 (HRP) 和100 μL，5 μg/mL的雌二醇抗体 (Ab)加入到2 ml的上述材料中，4℃下搅拌一夜；用PBS缓冲溶液清洗三次，得到纳米复合物标记层PDA‑PtNPs‑AuNP‑HRP‑Ab；(3) 检测17β‑雌二醇的电化学免疫传感器的制备步骤如下：5 mg GO‑PANI超声1h溶于5 mL DMF中，滴加20 μL的GO‑PANI溶液在玻碳电极表面，室温下晾干；将修饰的电极浸在含有1 mM HAuCl4 and 1 mM H2PtCl6的0.2 M的Na2SO4溶液中，通过恒电位方法进行扫描还原，扫描电位为‑0.2 V，扫描时间是300 s；这样在GO‑PANI表面修饰了一成Au‑PtNPs的纳米合金；滴加10 μl，10 μg/mL的17β‑雌二醇完全抗原在修饰好的电极表面，室温下干燥5 h；用10 μl BSA (1%)封闭的基本面残余的活性位点；每一步修饰后用PBS缓冲溶液曲线电极；得到制备的免疫传感器电极，4℃储存备用。