[发明专利]一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供的一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗，通过猪瘟病毒E2基因的合成、转移载体的构建、转移载体与线性杆状病毒的重组、重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定、猪瘟病毒E2蛋白的表达、猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活、猪瘟病毒E2蛋白与佐剂563VG乳化制成疫苗、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的安全性检验、猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗的效力检验等系列的研究证明，猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗做为一种新型的亚单位疫苗，不仅具有良好的安全性，而且免疫效力与猪瘟兔化弱毒疫苗效力相当。

主权项

1.一种新型猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗及其制备方法，其特征在于：分步实施；步骤1猪瘟病毒E2基因优化及合成：昆虫细胞内密码子偏嗜性进行猪瘟病毒E2基因的优化，将优化好的序列交与基因合成公司合成；步骤2转移载体的构建：通过TOPO^®克隆将合成的猪瘟病毒E2基因克隆到pENTR/D-TOPO^®载体上，构建出含有猪瘟病毒E2基因的pENTR-E2转移载体；步骤3转移载体与线性杆状病毒的重组：应用Invitrogen公司的BaculoDirect^TMBaculovirusExpressionSystem试剂盒将pENTR-E2转移载体与线性的杆状病毒进行重组反应，将猪瘟病毒的E2基因重组于杆状病毒；步骤4重组杆状病毒的分子生物学和免疫学鉴定：将上述重组后的杆状病毒在Sf-9细胞上增殖后取样，一份提取病毒基因，用猪瘟病毒E2基因的引物扩增E2基因；另一份通过SDS-PAGE和Western-blot方法确定E2蛋白表达和免疫原性，进行E2蛋白的表达；步骤5猪瘟病毒E2蛋白的表达：将重组杆状病毒以MOI为1接种于Sf-9细胞，培养4d，去细胞碎片，上清即为猪瘟病毒E2蛋白；步骤6猪瘟病毒E2重组杆状病毒的灭活：将BEI加入抗原中，终浓度为1mmol/L，置37℃灭活48h，即使重组病毒灭活;步骤7猪瘟病毒E2蛋白与563VG乳化制成疫苗：将猪瘟病毒E2蛋白与563VG按质量比1:1混合，采用均质机，在12000rpm条件下，将抗原液佐剂均质，时间为10min，即制成猪瘟病毒E2重组杆状病毒灭活疫苗。